文章导读
近年来，eccDNA（染色体外环状DNA）连登《Nature》《Cell》等期刊，彻底颠覆了人们对基因遗传的传统认知(颠覆性发现：癌基因竟不在染色体上 环状DNA连登Nature，Cell！)，成为了极具潜力的科研新热点（2020国自然研究热点—eccDNA的前世今生）。
近期，NIPT之父卢煜明教授基于转座酶和m5C位点酶学转化方法开发出了eccDNA甲基化测序技术，并揭示了孕妇血浆中的胎儿eccDNA甲基化状况，为eccDNA的深入研究及新型分子标志物的开发提供了新的技术手段。
作为国内提供eccDNA测序服务的公司，云序生物一直是eccDNA领域的领跑者。通过严谨的技术开发和质控，云序再次全国首发：eccDNA甲基化测序服务（全国首发！云序再推eccDNA重磅新品：eccDNA甲基化测序！）！
我们就为大家解读这篇eccDNA甲基化的文章，以及介绍云序生物eccDNA甲基化测序及相关产品。
发表杂志：Clinical Chemistry
影响因子：7.292
发表日期：2021.2
文章链接：Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance
作者采集了产后不同时间点的母体血浆，使用限制性外切酶对其中的eccDNA进行了纯化富集，然后构建了5-mC-Tn5转座子将eccDNA剪切成线性分子。通过酶处理使未发生5mC甲基化的C转化为U，再进行建库及高通量测序，分析得到eccDNA上发生甲基化的位点。
2. eccDNA和甲基化位点的分布
作者展示了血浆eccDNA的长度分布集中在202bp和338bp左右，胎儿来源的eccDNA比母体来源的eccDNA长度更短，甲基化密度更低。基因和基因间来源的EccDNA上CpG岛甲基化密度无显著差别，线性DNA和eccDNA的甲基化密度也未发现明显差别。另外，作者还用了对5mC敏感和不敏感的两种限制性内切酶验证了胎儿来源的eccDNA甲基化程度比母体来源eccDNA低。
3. eccDNA长度与甲基化密度的关联
作者分析测序数据发现，小分子eccDNA的甲基化密度低于长分子eccDNA。通过MspI/HpaII消化实验验证了这一趋势。
4. 胎儿eccDNA在母体循环中的清除
在分娩后0,30,60,120分钟分别采取母体血浆，测序发现胎儿来源的eccDNA和线性DNA占比迅速降低，两者的半衰期相似。
云序生物eccDNA甲基化测序
eccDNA大量存在与正常体细胞和癌细胞中，其上染色质高度开放，携带基因能够大量表达，可以影响细胞生命活动，在肿瘤发生发展机理研究中发挥着重大的潜在价值，并且可能成为一种新型特异的肿瘤标志物。而DNA甲基化又能控制基因表达，在动植物的生长发育过程中发挥着关键的调控作用，并且与多种人类疾病密切相关，是表观遗传学研究的热点。
云序生物作为追逐不断创新的科技创新型企业，在推出eccDNA测序的基础上，再次推出eccDNA甲基化测序服务，助力探索研究热点。
单碱基分辨的eccDNA甲基化分析
2. 加接头：通过转座酶打开eccDNA的环形结构，并在DN**段的两端加上接头。
3. 末端修复：通过Klenow酶修复转座产物的末端缺口。
4. C-U转化：通过温和的酶转化法，将未甲基化的胞嘧啶（C）高效地转化为尿嘧啶（U）。
5. PCR扩增：对转化后产物进行PCR扩增及纯化。
6. 上机测序：纯化后文库质检合格后进行上机测序。
云序eccDNA甲基化测序实例展示
实验项目：血浆eccDNA甲基化测序
A. 质控
1. 血浆cfDNA Qubit定量
通过Qubit荧光定量仪检测掺入样品DNA的特异荧光染料信号，从而对样品进行精确定量。
2. 文库2100质控
通过Agilent生物分析仪对测序文库进行质控。
3. FastQC质控
通过FastQC软件进行测序数据质控。
4. Read统计及转化率
对测序碱基质量(Q30)，Read及C-U转化率进行统计。
B. 数据展示
1. eccDNA的识别及甲基化水平
通过软件识别eccDNA的染色体坐标，长度及表达量
ecc_chr: eccDNA的染色体
ecc_start: eccDNA的起始位点
ecc_end: eccDNA的终止位点
ecc_location: eccDNA的染色体坐标
ecc_length: eccDNA的长度
T1，T2: 不同样品中某个eccDNA对应的原始split reads数目
Meth_Level_T1,T2: 不同样品中某个eccDNA的甲基化水平
2. eccDNA的基因注释
对eccDNA所在位置的蛋白编码基因的位置，基因名，基因ID等信息进行注释
chr, start, end: eccDNA所在区域的蛋白编码基因的基因组位置信息
gene_id: eccDNA所在区域的蛋白编码基因的gene ID
gene_name: eccDNA所在区域的蛋白编码基因的基因名
strand: eccDNA所在区域的蛋白编码基因所处的正负链信息
overlap: eccDNA与蛋白编码基因的重叠区域
3. eccDNA长度分布图
eccDNA的长度分布图表明：eccDNA在两个区域富集，一是~200bp的区域，另一个是300-450bp的区域。
4. eccDNA甲基化水平统计
不同功能区域的eccDNA的甲基化水平统计
eccDNA甲基化测序样品要求：
cfDNA: > 50 ng
血浆：> 5 mL
细胞：> 2 x 107
组织：> 100 mg
其他样品类型咨询021-64878766当地销售
云序生物eccDNA服务产品
1. 组织细胞eccDNA测序
基于circle-seq方法,利用A&A Biotechnology离子交换柱高效富集基因组DNA中的eccDNA，利用核酸酶消化除去残余线性DNA, 通过滚环扩增获得大量的eccDNA拷贝,再利用NGS测序高通量地检测样品中所有的环状DNA分子。
2. 血清血浆eccDNA测序
利用Tn5转座酶打开环状结构，高效检测循环系统中微量的eccDNA分子。
3. eccDNA甲基化测序
利用Tn5转座酶打开环状结构，用酶转化法将未甲基化的胞嘧啶（C）高效地转化为尿嘧啶（U）。实现单碱基分辨率的eccDNA甲基化检测
4. eccDNA sanger测序验证
针对eccDNA的连接位点设计反向引物，PCR后sanger测序验证连接位点处序列。
国自然热点之eccDNA研究思路解析讲座视频
往期eccDNA主题回顾
近年来，eccDNA（染色体外环状DNA）连登《Nature》《Cell》等期刊，彻底颠覆了人们对基因遗传的传统认知(颠覆性发现：癌基因竟不在染色体上 环状DNA连登Nature，Cell！)，成为了极具潜力的科研新热点（2020国自然研究热点—eccDNA的前世今生）。
近期，NIPT之父卢煜明教授基于转座酶和m5C位点酶学转化方法开发出了eccDNA甲基化测序技术，并揭示了孕妇血浆中的胎儿eccDNA甲基化状况，为eccDNA的深入研究及新型分子标志物的开发提供了新的技术手段。
作为国内提供eccDNA测序服务的公司，云序生物一直是eccDNA领域的领跑者。通过严谨的技术开发和质控，云序再次全国首发：eccDNA甲基化测序服务（全国首发！云序再推eccDNA重磅新品：eccDNA甲基化测序！）！
我们就为大家解读这篇eccDNA甲基化的文章，以及介绍云序生物eccDNA甲基化测序及相关产品。
影响因子：7.292
发表日期：2021.2
文章链接：Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance
文章内容
1. eccDNA甲基化鉴定实验方法作者采集了产后不同时间点的母体血浆，使用限制性外切酶对其中的eccDNA进行了纯化富集，然后构建了5-mC-Tn5转座子将eccDNA剪切成线性分子。通过酶处理使未发生5mC甲基化的C转化为U，再进行建库及高通量测序，分析得到eccDNA上发生甲基化的位点。
2. eccDNA和甲基化位点的分布
作者展示了血浆eccDNA的长度分布集中在202bp和338bp左右，胎儿来源的eccDNA比母体来源的eccDNA长度更短，甲基化密度更低。基因和基因间来源的EccDNA上CpG岛甲基化密度无显著差别，线性DNA和eccDNA的甲基化密度也未发现明显差别。另外，作者还用了对5mC敏感和不敏感的两种限制性内切酶验证了胎儿来源的eccDNA甲基化程度比母体来源eccDNA低。
3. eccDNA长度与甲基化密度的关联
作者分析测序数据发现，小分子eccDNA的甲基化密度低于长分子eccDNA。通过MspI/HpaII消化实验验证了这一趋势。
4. 胎儿eccDNA在母体循环中的清除
在分娩后0,30,60,120分钟分别采取母体血浆，测序发现胎儿来源的eccDNA和线性DNA占比迅速降低，两者的半衰期相似。
云序生物eccDNA甲基化测序
eccDNA大量存在与正常体细胞和癌细胞中，其上染色质高度开放，携带基因能够大量表达，可以影响细胞生命活动，在肿瘤发生发展机理研究中发挥着重大的潜在价值，并且可能成为一种新型特异的肿瘤标志物。而DNA甲基化又能控制基因表达，在动植物的生长发育过程中发挥着关键的调控作用，并且与多种人类疾病密切相关，是表观遗传学研究的热点。
云序生物作为追逐不断创新的科技创新型企业，在推出eccDNA测序的基础上，再次推出eccDNA甲基化测序服务，助力探索研究热点。
技术优势：
一箭双雕：同时检测eccDNA及其甲基化状况，节约样品，性价比高单碱基分辨的eccDNA甲基化分析
实验流程
1. EccDNA富集：通过核酸外切酶 V 消化等手段，去除样品中的线性DNA，从而达到富集eccDNA的目的。2. 加接头：通过转座酶打开eccDNA的环形结构，并在DN**段的两端加上接头。
3. 末端修复：通过Klenow酶修复转座产物的末端缺口。
4. C-U转化：通过温和的酶转化法，将未甲基化的胞嘧啶（C）高效地转化为尿嘧啶（U）。
5. PCR扩增：对转化后产物进行PCR扩增及纯化。
6. 上机测序：纯化后文库质检合格后进行上机测序。
云序eccDNA甲基化测序实例展示
实验项目：血浆eccDNA甲基化测序
A. 质控
1. 血浆cfDNA Qubit定量
通过Qubit荧光定量仪检测掺入样品DNA的特异荧光染料信号，从而对样品进行精确定量。
2. 文库2100质控
通过Agilent生物分析仪对测序文库进行质控。
3. FastQC质控
通过FastQC软件进行测序数据质控。
4. Read统计及转化率
对测序碱基质量(Q30)，Read及C-U转化率进行统计。
B. 数据展示
1. eccDNA的识别及甲基化水平
通过软件识别eccDNA的染色体坐标，长度及表达量
ecc_start: eccDNA的起始位点
ecc_end: eccDNA的终止位点
ecc_location: eccDNA的染色体坐标
ecc_length: eccDNA的长度
T1，T2: 不同样品中某个eccDNA对应的原始split reads数目
Meth_Level_T1,T2: 不同样品中某个eccDNA的甲基化水平
2. eccDNA的基因注释
对eccDNA所在位置的蛋白编码基因的位置，基因名，基因ID等信息进行注释
chr, start, end: eccDNA所在区域的蛋白编码基因的基因组位置信息
gene_id: eccDNA所在区域的蛋白编码基因的gene ID
gene_name: eccDNA所在区域的蛋白编码基因的基因名
strand: eccDNA所在区域的蛋白编码基因所处的正负链信息
overlap: eccDNA与蛋白编码基因的重叠区域
3. eccDNA长度分布图
eccDNA的长度分布图表明：eccDNA在两个区域富集，一是~200bp的区域，另一个是300-450bp的区域。
4. eccDNA甲基化水平统计
不同功能区域的eccDNA的甲基化水平统计
eccDNA甲基化测序样品要求：
cfDNA: > 50 ng
血浆：> 5 mL
细胞：> 2 x 107
组织：> 100 mg
其他样品类型咨询021-64878766当地销售
云序生物eccDNA服务产品
1. 组织细胞eccDNA测序
基于circle-seq方法,利用A&A Biotechnology离子交换柱高效富集基因组DNA中的eccDNA，利用核酸酶消化除去残余线性DNA, 通过滚环扩增获得大量的eccDNA拷贝,再利用NGS测序高通量地检测样品中所有的环状DNA分子。
2. 血清血浆eccDNA测序
利用Tn5转座酶打开环状结构，高效检测循环系统中微量的eccDNA分子。
3. eccDNA甲基化测序
利用Tn5转座酶打开环状结构，用酶转化法将未甲基化的胞嘧啶（C）高效地转化为尿嘧啶（U）。实现单碱基分辨率的eccDNA甲基化检测
4. eccDNA sanger测序验证
针对eccDNA的连接位点设计反向引物，PCR后sanger测序验证连接位点处序列。
国自然热点之eccDNA研究思路解析讲座视频
往期eccDNA主题回顾
全国首发！云序再推eccDNA重磅新品：eccDNA甲基化测序！
Cancer Cell研究新进展：eccDNA调控癌基因转录
斯坦福大学研究----肿瘤细胞中ecDNA机制
Nature重磅新星——eccDNA的物种发现史
2020国自然研究热点—eccDNA的前世今生
eccDNA新型生物标志物，卢煜明团队重磅成果！
再登Nature Genetics：ecDNA与致癌基因扩增及多种癌症不良预后相关
10分文章新利器----eccDNA开启2020年科研新热点
颠覆性发现：癌基因竟不在染色体上 环状DNA连登Nature，Cell！
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电话：021-64878766 邮箱：market@cloud-seq.com.cn