iTRAQ定量蛋白质组学分析研究狗牙根茎和枝叶差异
热烈祝贺扬州大学动物科技学院 张兵老师及其团队研究成果荣登BMC Genomics
基本信息
题目：Comparative proteomic analysis provides new insights into the specialization of shoots and stolons in bermudagrass (Cynodon dactylon L.)
期刊：BMC Genomics
影响因子：3.7
合作技术：iTRAQ
主要技术： iTRAQ蛋白组学 、RT-PCR、WB
研究背景：
狗牙根（Cynodon dactylon L.）作为一种重要的暖季型草种，广泛分布于世界的温暖地区，是家庭草坪、公园、高尔夫球场和运动场中使用最广泛的草坪草之一。狗牙根具有典型直立茎茎干和匍匐茎的野草特征，在形态学上具有高度的可塑性，其结构特征可以通过外部环境因素而改变。然而，茎和枝叶之间的内在差异仍不清楚，这些差异为狗牙根的形态变异提供了基础。近年来，通过运用高通量转录组学和蛋白质组学技术，为植物茎，特别是枝叶和匍匐茎的生长和发育提供了许多新的见解。在这项研究中，作者首次比较了阳江狗牙根品种在同一发育阶段的枝叶和匍匐茎蛋白质组，分析差异蛋白及代谢通路，这些结果不仅扩展了对匍匐茎与枝叶专业化的理解，而且也为具有不同植物结构的狗牙根和其他草坪草的育种提供了线索。
技术路线：
1、狗牙根匍匐茎与枝叶在形态学和解剖学上的差异
作者首先从形态上比较了匍匐茎与枝叶的差异，为了揭示两种不同类型茎在细胞水平上的差异，作者运用光学显微镜观察比较两者的横截面。
图1 形态学和解剖学观察，显示狗牙根匍匐茎与枝叶差异
阳江狗牙根匍匐茎长势较好但枝叶相对长势较弱（图1a）。匍匐茎与枝叶均有典型的植物体节组成，包括节和节间。叶从枝节生长，新芽从茎节发芽。有趣的是，茎是匍匐生长，而枝叶则直立生长。尽管他们的节间直径没有显着差异，但匍匐茎的节间长度明显长于枝叶（图1b）。在光学显微镜下观察结果显示：被脉管束包围的枝叶实质细胞的体积大于匍匐茎实质细胞的体积；木质素染色结果表明匍匐茎中的血管束和表皮被严重木质化（图1c和d）；淀粉染色结果进一步显示，匍匐茎中薄壁组织细胞淀粉比枝叶中积累的更多（图1e和f）。2、狗牙根匍匐茎与枝叶的节间蛋白质组比较
为了探索狗牙根匍匐茎与枝叶在形态学和解剖学差异的潜在机制，作者运用iTRAQ定量蛋白质组学技术，检测两种不同类型茎的差异蛋白。
图2 匍匐茎与枝叶的节间蛋白质组比较
总共鉴定出4188种蛋白质，其中包含23581种肽段。在4188种蛋白质中，有3002种至少含有两个特有肽段，覆盖度大于等于20%的蛋白数有1867种（图2a和b）。 变异系数（CV）用于评估生物样本的重复性。结果表明当CV的阈值设置在20%时，两组样本的CV累计百分比分别为78.02和68.5％（图2c）。 两组之间的比较表明，大多数蛋白质在匍匐茎和枝叶显示出相似的丰度，有8.98％（376）的蛋白质显示显着差异（图2d）。 3、iTRAQ定量蛋白质组与转录组的关联分析及RT-qPCR验证
作者将蛋白质组学结果与转录组学结果进行了关联分析，并对蛋白组学结果进行了RT-qPCR验证。
图3 蛋白质组与转录组的关联分析及RT-qPCR验证
BLAST结果显示，编码113个差异蛋白（DAP）的基因同时也是转录组差异表达的基因（DEG），其余编码263个DAP的基因未被鉴定到（图3a）。iTRAQ定量蛋白质组结果与转录组数据结果的比较表明，多达93个DAP和相应的DEG表现出相似的蛋白质丰度变化和mRNA表达变化趋势（图3b）。RT-qPCR结果表明，10个基因的差异表达，与组学结果相符（图3c）。但是，有2个基因表达差异倍数在mRNA水平与蛋白质水平上均不同，这表明这些基因的表达在转录后受到调控。4、差异蛋白的功能富集分析
为了探究差异蛋白的潜在功能，作者对差异蛋白进行了GO和KEGG富集分析。
图4 显著富集的代谢通路
GO注释分析表明376个DAP可注释到29个功能分类上，盖了许多重要的生物学和细胞过程，包括代谢，运输，生长，发育，转录，信号转导和对刺激的反应。这些结果表明，许多重要的生物过程在匍匐茎与枝叶中受到不同的调节。KEGG注释分析进一步表明，在匍匐茎中有5条显著富集的代谢通路，在枝叶中有9条显著富集的代谢通路（图4）。
图5参与碳水化合物代谢途径的差异蛋白质种类
根据组学结果，催化糖酵解必不可少的酶，包括焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP)，果糖二磷酸醛缩酶（ALDO），磷酸甘油酸变位酶（PGAM）和bing酮酸激酶(PK)，这些蛋白在枝叶中的蛋白丰度要高于匍匐茎（图5）。催化蔗糖降解和细胞壁成分（纤维素和木质素）合成的酶，包括蔗糖合酶（SuS）的三种同工型，苯丙氨酸氨解酶（PAL）的三种同工型，UDP葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）和 纤维素合酶（CS），也是在枝叶中表达较高（图5）。相反，参与淀粉合成的酶，包括AGPase，淀粉合酶（SS），1,4-α-葡聚糖分支酶（GBE）和异淀粉酶（ISA），在匍匐茎中有更高的蛋白质丰度（图5）。5、狗牙根匍匐茎与枝叶中AGPase和PK的酶活性
AGPase和PK分别是淀粉合成和糖酵解途径的两种限速酶。为了进一步证实iTRAQ定量结果，验证AGPase和PK蛋白质的丰度，作者运用WB验证技术。另外，作者还测定了AGPase和PK的酶活性，并进行了比较分析。
图6 五种狗牙根茎和枝叶中AGPase及PK的蛋白丰度及酶活性比较
结果表明，AGPase和PK分别在茎和枝叶中优势表达（图6a）。在狗牙根的其他四个野生种中也观察到了相似的结果。此外，阳江品种和C437和C452野生种的茎显示出比野生种C690和C726较高的AGPase蛋白丰度，尽管二者枝叶中也有相对较高的AGPase表达（图6a）。与iTRAQ定量和WB分析结果一致，茎中的AGPase活性高于枝叶中的AGPase活性，而枝叶中的PK活性更高（图6b和c）。此外，阳江品种的茎和枝叶与野生种C437和C452之间的AGPase活性差异大于野生株C690和C726的茎和枝叶之间的AGPase活性差异，而后两个野生种的PK活性差异更大。这些结果与KOBAS分析结果相结合，共同暗示淀粉合成和糖酵解分别在茎和枝叶中具有很高的活性。6、狗牙根匍匐茎与枝叶中可溶性糖和淀粉含量
作者进一步测定了五株狗牙根匍匐茎与枝叶中可溶性糖和淀粉的含量。
图7 五种狗牙根茎和枝叶中碳水化合物含量比较
在五种植物中，枝叶比茎含有更多的可溶性糖及更少量的淀粉，这与淀粉染色结果一致（图7a和b）。具体而言，五种狗牙根的茎中均显示相似的可溶性糖含量，而野生种C690和C726的茎中可溶性糖含量明显高于其他三株（图7a）。 同样，野生种C690和C726的枝叶淀粉含量比阳江和野生种C437和C452的淀粉含量高1.5倍。相反，野生种C690和C726的茎淀粉含量明显低于其他三种狗牙根（图7b）。
图8 五种狗牙根表型比较
有趣的是，五株狗牙根也表现出明显的形态变异（图8a）。具体而言，五株植物的苗高不同（图8a）。野生种C690和C726的最高枝叶分别达到25 cm和18 cm，均明显高于阳江品种和野生种C437和C452的高度（图8b）。因此，野生种C690和C726的茎/枝干重量比明显低于其他三种植物（图8c）。这些结果表明，在枝叶中积累并消耗更多糖的狗牙根品种，其长势要比在茎中储存更多淀粉的品种高。结论：
该研究中，作者主要运用iTRAQ定量蛋白质组技术比较了阳江狗牙根匍匐茎与枝叶蛋白质组，成功鉴定到在茎和枝叶中优势表达的蛋白，通过对这些蛋白的功能注释分析，找出了他们显著富集的代谢通路。作者同时也结合了转录组学关联分析、RT-qPCR和WB实验技术对蛋白组学结果进行验证，通过酶活性比较、碳水化合物含量比较等实验，揭示了参与淀粉合成和糖酵解的酶在茎和枝叶中分别显示出相对较高的丰度和活性，再加上茎中有较高的淀粉含量，而枝叶有较高的可溶性糖含量，这些结果都强有力的表明在狗牙根快速繁殖生长期间，茎和枝叶专门用于不同生理功能。