NMT作为生命科学底层核心技术，是建立活体创新科研平台的必备技术。2005年~2020年，NMT已扎根中国15年。2020年，中国NMT销往瑞士苏黎世大学，正式打开欧洲市场。
基本信息
主题：NMT发现盐胁迫下耐盐杨树根吸氧更多促线粒体呼吸以激活H+泵促排Na+
期刊：Tree Physiology
影响因子：3.665
研究使用平台：NMT植物耐盐创新平台
标题：NaCl-altered oxygen flux profiles and H+-ATPase activity in roots of two contrasting poplar species
作者：北京林业大学陈少良、马秀英、邓晨、李金克
检测离子/分子指标
O2，Na+，H+
检测样品
胡杨（Poplus euphratica）、群众杨（Poplus popularis）的根，距根尖100、600、1100、1600、2100、2600、10000、10500、11000、11500、12000、12500 μm根表上的点。
中文摘要（谷歌机翻）
维持线粒体呼吸对于H+泵ATP在盐胁迫下排出Na+至关重要。本文研究了NaCl胁迫对胡杨（耐盐）和群众杨35-44（盐敏感）O2吸收、线粒体呼吸和H+-ATPase活性的影响。与群众杨相比，胡杨根系在NaCl胁迫（150 mM）下表现出更强的Na+外排能力。用Pb(NO3)2染色进行的细胞化学分析表明，在长期（LT）增加盐胁迫（50~200 mM NaCl, 4周）的过程中，胡杨根细胞比盐敏感的杨树保留了更高的H+水解活性。质子泵的长期持续激活需要通过有氧呼吸来提供持久的能量（ATP）。利用非损伤微测技术（NMT）对盐胁迫下根系O2吸收的种类、空间和时间差异进行了研究。虽然盐诱导的O2瞬态动态变化与高渗冲击（255 mM甘露醇）引起的O2的剧烈下降有明显区别，但胡杨在NaCl实时处理（150 mM）时的吸氧量下降幅度小于群众杨。短期（ST）处理（150 mM NaCl, 24 h）刺激了胡杨根系O2的内流，LT处理胡杨根系O2的内流速率沿根轴增加，而群众杨的根系O2内流速率则随盐度的增加而下降。在ST和LT胁迫期间，高浓度NaCl（150、200 mM）处理下，O2内流速率的空间定位表明，根尖区比伸长区更易受到影响。药理学实验表明，当线粒体呼吸抑制剂NaN3抑制O2的吸收时，盐渍化的根中的Na+外排和H+-ATPase活性会受到相应的抑制。因此研究认为，稳定的线粒体呼吸使胡杨根细胞的H+-ATPase能在盐环境下维持Na+稳态。
离子/分子流实验处理
1. 150 mM NaCl或255 mM等渗甘露醇实时处理。
2. 短期胁迫（ST）：150 mM NaCl胁迫24 h。
3. ST胁迫之后，2 mM NaN3（线粒体呼吸抑制剂）处理20 min。
4. 长期胁迫（LT）：NaCl浓度从第一周的50 mM开始，每周增加50 mM，最后一周达到200 mM。
离子/分子流实验结果
利用NMT在通常观察到峰值的根尖区和伸长区检测O2流速。流速数据显示，两种杨树根系均有O2的净流入，但群众杨的流速比胡杨的流速大30~42 pmol cm-2s-1（图1）。根尖区（距根尖0.1~2.6 mm）O2内流速率大于伸长区（距叶尖10.0~12.5 mm, 图1）。
图1. 胡杨和群众杨根尖区和伸长区O2内流。
在距根尖1.1 mm的根尖区检测O2流速对NaCl或高渗胁迫（甘露醇）的响应。NaCl（150 mM）的加入使两种杨树的O2流速立即降低，且随着盐胁迫时间的延长，流速逐渐降低（图2A）。与耐盐杨树相比，盐敏感的群众杨O2内流速率下降的更为明显（图2A, B）。NaCl实时胁迫10 min后胡杨O2流速趋于稳定，而群众杨O2流速持续下降，直至观察时间结束（图2A）。
高渗处理的杨树根系O2实时动态变化与NaCl实时处理的根系不同。在受到255 mM甘露醇引起的等渗胁迫后，胡杨和群众杨的O2内流立即减少48~57%，随后在记录期间内保持恒定（图2C）。实时流速数据显示，高渗处理对O2内流产生了比盐离子更明显的限制作用（图2B, D）。
图2. NaCl和高渗胁迫实时处理对胡杨和群众杨根部O2实时动态变化的影响。
150 mM NaCl 短期（ST, 24 h）处理后，胡杨根系稳态O2流速的模式与群众杨不同。研究观察到ST处理后的胡杨根系氧内流速率增加（图3A）。在群众杨根系中，NaCl处理降低了根尖区的O2流速，但在伸长区的O2流速变化不明显（图3B）。为确定盐刺激的胡杨根系O2内流是否是线粒体呼吸被激活的结果，采用线粒体呼吸抑制剂NaN3抑制细胞色素途径。抑制剂NaN3显著降低了NaCl胁迫下胡杨根中O2的内流（图3C），表明ST处理激活了胡杨根细胞的线粒体呼吸。抑制剂NaN3能够显著降低ST处理下群众杨根系中O2的内流速率（图3D），表明植物的线粒体呼吸受到严重抑制。
图3. NaCl和线粒体呼吸抑制剂（NaN3）对胡杨和群众杨根部稳态O2流速的影响。
群众杨是一种盐敏感树种，因此在4周的处理中以50、100、150、200 mM递增的方式增加盐分。 在增加盐分处理期间每周检查稳态O2流速。胡杨和群众杨在50 mM NaCl胁迫1周后，沿根轴O2内流速率增加，尽管耐盐杨树受到了更明显的刺激（图4A, B）。然而，在第2周100 mM NaCl胁迫下，群众杨不存在盐刺激的O2吸收（图4D）。本研究注意到，暴露在较高盐度下，即第3周150 mM NaCl和第4周200 mM NaCl，引起了群众杨中O2内流速率的显著下降，且这种影响在根尖区更为明显（图4F, H）。与盐敏感杨树相比，在盐胁迫期间，胡杨表现出沿根轴的O2内流增加，但刺激效果随盐度的增加而下降（图4A, C, E, G） 。
图4. 长期增加NaCl对胡杨和群众杨根部O2流速的影响。
木本植物和草本植物的耐盐性在很大程度上是由Na+从细胞质中排出所介导的。为证实盐环境下胡杨根细胞稳定的线粒体呼吸是否能激活H+-ATPase以维持Na+稳态，本研究在盐胁迫下，检测了线粒体呼吸抑制剂NaN3对Na+外排和体内H+-ATPase活性的影响。NaCl（150 mM, 24 h）引起两种杨树根尖Na+外排显著增加（图5A）。值得注意的是，在NaCl处理下胡杨根系的Na+外排速率明显高于群众杨（图5A）。然而，抑制剂NaN3显著降低了NaCl胁迫下根系Na+外排速率（图5A），表明线粒体呼吸受到抑制后，Na+外排减少。在无盐对照条件下，NaN3没有明显改变Na+流速，这在两种杨树中几乎无法检测到（图5A）。
用NMT研究了NaCl胁迫下根中PM H+-ATPase的活性。NaCl处理（150 mM, 24 h）使H+的净内流速率在两个杨树根系中增加（图5B），这是Na+/H+跨PM逆向转运所致的（图5A, B）。NaN3增加了盐刺激下的H+内流（图5B），而抑制剂处理的根系中没有相应的增加Na+外排（图5A）。因此，抑制剂引起的H+内流主要是由质膜H+-ATPase产生的H+外排减少引起的。此外，NaN3导致两种杨树对照根中H+内流的增加（图5B），这是由于抑制剂处理下根中H+泵活性降低所致。
图5. NaCl和线粒体呼吸抑制剂（NaN3）对胡杨和群众杨根系Na+和H+稳态流速的影响。
图6. 植物根部检测图
其他实验结果
- 50 mM NaCl处理1周后，群众杨根部的整体呼吸量增加。然而，随着NaCl浓度和盐胁迫时间的增加，群众杨根部的呼吸速率呈下降趋势，呼吸速率在第3~4周达到最低值。与群众杨相反，NaCl处理的胡杨根的呼吸速率在处理1周后明显增加，在随后的3周盐胁迫中仍比对照植物高36~44%。
- 细胞化学染色结果显示，盐胁迫1周后，胡杨和群众杨皮层细胞的质膜中染色强度增加。然而，在高NaCl处理的最后2周（150, 200 mM），群众杨细胞中H+-ATPase的活性明显下降。与群众杨树相比，胡杨根细胞在高盐处理期间保持了H+-ATPase的活性。
结论
氧流速数据表明，在实时盐胁迫、ST和LT盐胁迫下，胡杨根系表现出较强的维持线粒体呼吸的能力。在盐环境下，稳定的线粒体呼吸使胡杨根细胞的H+-ATPase能在盐环境下维持Na+稳态。
测试液
O2：0.1 mM CaCl2, 0.5 mM KCl, pH 6.0
Na+、H+：0.5 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM NaCl, 2.5% sucrose, pH 5.8
仪器采购信息
- 据中关村NMT产业联盟了解，北京林业大学于2009年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统。
文章原文：https://academic.oup.com/treephys/advance-article/doi/10.1093/treephys/tpaa142/5940447
关键词：根；质膜H+-ATPase；细胞化学染色；线粒体呼吸；O2内流；杨树；NaCl；NMT