目前m6A修饰的研究如火如荼，共计发表文章已达3000+篇，且每年仍呈指数上涨的趋势。针对m6A的研究主要包括两大方面：（1）编码RNA上m6A修饰调控表达；（2）非编码RNA（包括lncRNA、circRNA、miRNA等）中m6A修饰调控下游表达。然而非编码RNA发表的文献还较少，目前针对非编码RNA的研究仍具有非常广阔的空间。云序生物现已发表多篇非编码RNA研究文章，这次我们以云序客户发表的circRNA+m6A方向文章为例，帮助老师掌握短平快发表5分circRNA修饰谱学文章思路。
案例解析
文章1：胶质母细胞瘤circRNA m6A修饰表达谱
发表日期：2021年6月27日
影响因子：5.109
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章链接：Identification and characterization of N6-methyladenosine modification of circRNAs in glioblastoma
实验背景：
胶质瘤是一种常见的脑肿瘤，约占所有原发性脑肿瘤的80%。最近的表观遗传学研究发现，RNA转录后修饰在调节细胞生长和代谢以及肿瘤的生物学行为中起着至关重要的作用。然而circRNA的m6A修饰在GBM发病机制中的作用仍然不清楚。
实验设计：
本文通过m6A MeRIP-seq结合RNA-seq，分析了环状RNA中m6A修饰在胶质瘤发展进程中的调控机制。本文思路设计如下：
（1）甲基化水平整体分析
本研究通过m6A MeRIP-seq测序采用饼图、韦恩图、motif图等形式展示了胶质母细胞瘤(GBM）组织和正常大脑皮质组织中circRNAs的整体m6A修饰情况。
分析比较两组间发生差异甲基化修饰的circRNA，采用散点图展示了差异甲基化修饰的circRNA。此外也分别展示了差异峰所在circRNA的基因组分布、长度分布以及染色体分布等信息。
通过两组学联合分析发现在m6A修饰水平改变的基因中，有1298个表达上调，1905个下调。且m6A水平与circRNA表达呈正相关。分别采用散点图、热图等展示了既发生差异甲基化又发生差异表达的基因。
分别对差异（上调或下调）的甲基化circRNA的来源基因进行GO和KEGG功能富集分析，从而从生物学功能的方向找出m6A修饰circRNA可能参与的功能通路，从生物学功能的角度解析m6A修饰circRNA对胶质瘤进程的调控。
此外，本文通过MeRIP-qPCR验证并结合临床数据鉴定了5个相关分子（BUB1、C1S、DTHD1、F13A1和NDC80），这些分子可能是进一步研究m6A介导GBM发展的功能和机制的初步候选分子。
文章2：缺氧介导的肺动脉高压大鼠模型中circRNA m6A甲基化综合分析
发表日期：2020年1月13日
影响因子：3.969
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章链接：Transcriptome-wide map of m6A circRNAs identified in a rat model of hypoxia mediated pulmonary hypertension
实验背景：
低氧介导肺动脉高压（HPH）是一种致命性疾病，目前尚无有效的治疗方法。近期研究发现circRNA受m6A修饰的调控，而circRNA的m6A修饰在HPH中作用仍不清楚。
实验设计：
本文通过m6A MeRIP-seq结合RNA-seq，分析了环状RNA中m6A修饰在HPH中的调控机制。本文思路设计如下：
（1）甲基化水平整体分析
m6A MeRIP-seq测序后采用热图展示了每个样品中基因甲基化修饰水平，箱图从整体上展示了正常组样品和HPH组样品中的甲基化水平。m6A修饰在环状RNA类型上的偏好性以及每个circRNA外显子上m6A修饰的位点数也做了饼图和柱状图的展示。这部分结果从整体上展示了正常组织和HPH组织circRNA上m6A的修饰情况，为后续研究进行铺垫。
（2）差异甲基化分析
分析比较两组间发生差异甲基化修饰的circRNA，针对上调、下调相关circRNA进行长度及染色体分布特征分析，并分别用韦恩图、散点图以及累计分布图展示了两组间差异甲基化修饰情况。为筛选靶标基因提供基础。
通过两组学联合分析采用散点图展示了既发生差异甲基化又发生差异表达的基因情况。针对上述circRNA来源基因进行了GO和KEGG富集分析，将m6A修饰差异且表达差异的circRNA来源基因转化为具有生物学意义的通路富集基因，从而进一步对其功能进行了解，有利于后续指标的筛选。
为探索受m6A修饰调控的circRNA的作用机制，研究者从与PH过程有关的miRNA入手进行了 circRNA-miRNA-mRNA网络构建，从而确定了两个与研究密切相关的circXpo6和circTmtc3。
为确定circRNA在两组间差异表达且发生差异m6A修饰，作者进行了circRNA结构及表达量鉴定，此外通过MeRIP-qPCR对其修饰水平也进行了鉴定。这一结果说明m6A修饰调控的circRNA的表达可能参与到HPH的发展过程中。
云序生物m6A修饰研究五大模块
01 m6A RNA修饰测序
m6A RNA修饰测序（m6A-MeRIP-seq）
对m6A RNA甲基化，目前流行的检测手段为m6A-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：
- m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
- m6A LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
- m6A Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
- m6A mRNA测序
- m6A miRNA测序
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平
03 m6A RNA修饰上游酶的筛选
m6A RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。
云序生物服务优势
优势一：发表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化测序服务平台。云序已累计支持客户发表52篇高水平文章，合计影响因子450分+，是国内支持发文最多、累计影响因子最高的公司。
优势二：至今完成4000+例 m6A测序样本，覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：独家提供m6A一站式服务：m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。
优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：国内最全的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
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