研究背景
造血干细胞（HSCs）的增殖异常会导致白血病、贫血、免疫缺陷等疾病的发生。通过促进HSCs增殖获取足够HSCs进行血液移植是治疗血液系统疾病（白血病等）的关键。已知细胞增殖与聚合酶II介导的mRNA转录以及囊泡转运有关，但RNA聚合酶II各个亚基的入核机制仍不清楚，且囊泡转运驱动HSCs增殖的分子机理仍值得深入探究。
研究概述
2024年3月，中国科学院重庆绿色智能技术研究院、西南大学李礼课题组和罗凌飞课题组在Nature Communications杂志上发表了题为“TANGO6 regulates cell proliferation via COPI vesicle-mediated RPB2 nuclear entry”的文章。该研究综合利用细胞系以及小鼠等模型，揭示转运和高尔基体组织—TANGO6通过外壳蛋白复合物I（COPI）囊泡转运调控RNA聚合酶II亚基—RPB2入核驱动细胞增殖这一新机制，并强调了其在促进HSCs增殖中的重要作用。（麦特绘谱提供[2,3-13C2]标记的丙氨酸代谢流检测技术）
技术路线图
研究结果
1. TANGO6亚细胞定位和拓扑结构鉴定
基于HeLa细胞探究COPI囊泡在整个细胞周期中的调节机制，发现高尔基体衍生的COPI囊泡是细胞质中TANGO6的关键载体，并且在细胞周期进程中动态分布。随后研究COPI囊泡转运TANGO6的机制，借助不同数据库分析TANGO6的氨基酸序列，预测了6个推定的跨膜结构域和一个信号锚点。进一步通过实验证实TANGO6的N端以及C端均定位在细胞浆中，通过一个信号锚以及两个跨膜结构域锚定在COPI囊泡上，从而随着COPI囊泡运动。
免疫荧光染色图像表明TANGO6 WT和TANGO6 KO细胞都含有丙氨酸。基于[2，3-13C2]标记丙氨酸的代谢流分析（麦特绘谱提供服务）结果显示，丙氨酸水平在WT细胞沉淀中逐渐减少，在TANGO6 KO细胞沉淀中以更快速率下降，暗示TANGO6参与蛋白质分泌。
图1. COPI囊泡中TANGO6的拓扑结构
2. TANGO6通过COPI-SNARE-ER通路进入细胞核
除了TANGO6在细胞质中的动态分布外，在细胞核中也观察到TANGO6信号。已知可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）复合物介导的膜融合在货物通过COPI囊泡从高尔基体到内质网（ER）的逆向运输中起着至关重要的作用，Co-IP结果表明，TANGO6与N-乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白（NSF，一种参与SNARE复合物介导膜融合的关键ATP酶）相互作用，提示COPI-SNARE-ER通路参与了TANGO6的入核。
Co-IP结果表明，TANGO6和富含亮氨酸的重复序列59（LRRC59）之间存在强大的相互作用。敲低KPNB1导致细胞核中TANGO6信号急剧减少，并伴随TANGO6在细胞质中的积累结合。结合siRNA干扰技术结果，最终明确TANGO6经COPI囊泡转运至内质网后，通过SNARE复合体介导的膜融合进入内质网，并在LRRC59和KPNB1的帮助下进入细胞核。
图2. TANGO6的入核由SNARE复合体、ER和KPNB1辅助
3. TANGO6可携带RPB2到细胞核
TANGO6不与染色质结合，推测其可能参与了各种因子向细胞核的转运，因此对神经胶质瘤细胞系U251进行质谱分析以鉴定候选分子。结果表明，RNA聚合酶II复合物的第二大亚基—RPB2与TANGO6表现出实质性的相互作用，随后的Co-IP实验证实了HeLa和U251细胞中TANGO6和RPB2之间的强相互作用。进一步，敲降TANGO6后发现RPB2累积在细胞浆中，无法入核。并随后证实了TANGO6通过COPI囊泡介导的运输将RPB2转运到细胞核，并得到了来自内质网的KPNB1的协助，整体表明TANGO6-RPB2轴在细胞增殖中起着不可或缺的作用。
图3. TANGO6可携带RPB2到细胞核
4. TANGO6-RPB2轴在造血过程中被HSC广泛使用
继续探索TANGO6-RPB2轴在体内的作用。建立传统的Tango6敲除小鼠，发现小鼠HSCs的产生不受影响，但在HSCs的增殖期（E12.5-E16.5）cKO小鼠通体变白，胎肝变小无血色。通过流式细胞术发现HSCs的数量在突变体中显著降低，且Tango6缺陷会影响小鼠HSCs中RPB2入核受阻，而过表达Tango6后HSCs数目增加，表明TANGO6-RPB2信号轴在生物体内的重要功能之一是调控HSCs的增殖。
图4. TANGO6-RPB2轴对小鼠造血干细胞在体内的扩增至关重要
研究结论
本研究基于细胞系及小鼠等模型，以TANGO6为切入点，运用Co-IP、流式细胞术、同位素标记的代谢流等方法，揭示了RNA聚合酶II亚基的入核机制与TANGO6、RPB2和COPI囊泡转运系统的协同作用紧密协调有关。COPI囊泡相关的TANGO6通过逆行转运将RPB2携带到内质网中，在LRRC59和输入蛋白的帮助下携带到细胞核，以确保细胞增殖过程中的顺利进展。此项研究为实现有效在体外扩增干细胞或并将其作为潜在治疗靶点来缓解和治疗肿瘤提供理论指导。
参考文献
Feng Z, Liu S, Su M, et al. TANGO6 regulates cell proliferation via COPI vesicle-mediated RPB2 nuclear entry. Nature Communications. 2024.
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