血流感染（Bloodstream infection，BSI）是一种严重的全身性感染，可能引起一系列症状如高热、寒战、心动过速、呼吸急促等，在严重情况下会导致休克和多器官功能衰竭。这种疾病通常由革兰氏阴性菌引起，包括大肠杆菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）。以往针对BSI的研究多集中于严重感染对人体代谢的影响及可能的临床标志物筛选，往往忽略了微生物的代谢活动。
2024年6月，哈佛医学院及化学系研究团队在Cell上发表了题为“A metabolomics pipeline highlights microbial metabolism in bloodstream infections”的研究论文，提出了一种迭代的菌群衍生代谢物检测方案，首次发现了BSI期间上调的菌群代谢产物：乙酰化多胺类物质，并确定了关键酶及靶向药物作用机制。
技术路线图
分析结果
1. 筛选与BSI相关的细菌衍生代谢物
为确定BSI期间病人血浆中含量升高的菌源性代谢物，研究者设计了一组包含患者样本、小鼠模型和体外培养细菌的代谢组检测方案。首先对临床上革兰氏阴性菌感染患者的血浆样本进行靶向代谢组检测，发现几种短链肉碱和多胺衍生物等物质显著增加，其中8种代谢物的水平与急性生理学和慢性健康评估II（APACHE II）呈显著正相关；随后提取脓毒症盲肠浆液分别进行小鼠造模和体外细菌培养，最终筛选出两种关键代谢物：N-乙酰腐胺（N-acetylputrescine）和4-乙酰胺基丁酸盐（4-acetamidobutanoate），两者均是由多胺类物质——腐胺乙酰化得到；最后利用腐胺分别培养大肠杆菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），发现所有菌株均产生N-乙酰腐胺，而只有铜绿假单胞菌能产生4-乙酰氨基丁酸盐。
图1. 靶向代谢组学确定BSI患者血浆中升高微生物衍生代谢物
此外，为了证明这套工作流程还能对未知细菌代谢物进行优先级排序，研究者对以上患者样本、小鼠血浆和细菌培养上清液又进行了非靶向代谢组学检测，所有结果依旧指向N-乙酰腐胺；进一步通过关联临床疾病严重程度评分，发现了两种m/z为230.1852和114.0912的未知化合物，核磁共振解谱表明这两种物质是2-或3-乙酰吡咯烷和N1,N8-二乙酰亚精胺，后者是一种乙酰化多胺；基于此，研究者特别关注了乙酰化多胺类物质，发现多种造模方式的细菌活体感染均可使小鼠体内的多种乙酰化多胺含量上升，而LPS处理的无菌炎症造模则未出现此类规律。
图2. 非靶向代谢组学鉴定新的关键代谢物
2.革兰氏阴性菌中多胺乙酰化的关键酶：SpeG
为研究多胺乙酰化在BSI进展中的作用，必须首先确定负责这一过程的酶，研究者迅速聚焦多胺/二胺N-乙酰转移酶，顾名思义这类酶能催化多胺或二胺类物质的N-乙酰化反应。在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中，有一个基因：SpeG，被注释为腐胺N-乙酰转移酶，但之前的研究认为它只能催化亚精胺的乙酰化，而缺乏针对腐胺的研究结论。
因此，研究者构建了敲除SpeG基因的大肠杆菌突变体，首先确认了SpeG的缺失使得这些细菌在培养过程中无法产生N-乙酰腐胺和二乙酰亚精胺，而加入编码speG的质粒则可以回补；另外通过将纯化酶和腐胺及乙酰辅酶A一起孵育证明了SpeG可催化腐胺乙酰化。接下来检测SpeG对腐胺的动力学参数，发现在生理水平下，SpeG对腐胺的催化活性极低，但当腐胺的浓度超过生理阈值后，SpeG的活性会迅速增加，这也解释了为何以往的研究没有发现SpeG对腐胺的催化活性。最后研究了铜绿假单胞菌中是否存在SpeG的同源基因，通过UniProt数据库比对和BLAST搜索找到3种候选酶，随后在SpeG敲除的大肠杆菌中分别转染这3种基因，发现其中1种：PA1472，可以回补两种目标代谢物；此外AlphaFold2的结构预测结果也显示，PA1472与SpeG晶体结构相似；因此，即使同源性较低，但依旧可以认为PA1472是铜绿假单胞菌中的SpeG类似物。
图3. SpeG及其同源物催化细菌产生N-乙酰腐胺
3. 多胺乙酰化对细菌增殖的影响
多胺在基因表达和蛋白质翻译的调节中发挥作用，可参与维持细胞膜稳态和保护机体免受氧化应激损伤。研究者首先尝试从临床分离出的大肠杆菌中直接敲除speG基因，发现细菌死亡。随后使用CRISPRi系统抑制接近70%的speG基因转录，观察到大肠杆菌出现生长缺陷，增殖受到抑制；细胞外N-乙酰腐胺和二乙酰亚精胺含量显著降低，而细胞内腐胺积累显著增加，且额外补充N-乙酰腐胺不能挽救细菌的增殖缺陷；最后，在小鼠模型中进行体内实验，发现抑制speG的转录后，小鼠的生存时间显著延长。
图4. 抑制SpeG表达影响细菌增殖
以上结果表明，speG介导的多胺乙酰化代谢过程在病原细菌的体内生理学中发挥重要作用。
4.抑制SpeG可减少细菌增殖，同时降低抗生素耐药性
由于目前还没有一款针对细菌SpeG的小分子抑制剂可以使用，因此研究者选择了一种人类多胺N-乙酰基转移酶SAT1的抑制剂：Diminazene，这是一种抗癌药物。结果表明，Diminazene针对speG的IC50与针对SAT1的类似，能够显著降低胞外N-乙酰腐胺和双乙酰亚精胺含量，并且促进细胞内腐胺积累。
图5. 抑制SpeG活性可增强细菌膜的透性，抑制细菌增殖
前文已知多胺可调节细菌的多种细胞过程，这些过程可能对多胺代谢的扰动非常敏感，而这也正是抗生素的靶点，比如DNA复制/转录（喹诺酮类），翻译（大环内酯类和四环素类）和细胞壁/膜（β-内酰胺类和万古霉素）。因此研究者在大肠杆菌临床分离株中进行了Diminazene和临床抗生素的药物协同作用试验，发现它可以降低万古霉素的MIC90，据此推测抑制SpeG可增加细菌外膜的透性，使得难以进入的大型糖肽类药物能够顺利与胞质中的靶点结合从而发挥作用。
图6. 阻断SpeG与现有临床抗生素联用，对耐药细菌具有协同作用
研究结论
本研究提出了一种从复杂的宿主环境中分析微生物衍生代谢物的代谢组学研究流程，并应用于研究革兰阴性菌血流感染（BSI），发现BSI期间细菌代谢物：乙酰化多胺的水平升高，且筛选出负责其产生的酶是SpeG。在临床应用方面，本研究发现阻断SpeG活性可减少细菌增殖，减缓发病，同时SpeG活性降低还可增强细菌膜通透性，增加细胞内抗生素积累，从而减轻抗生素耐药性增加药物抗菌活性。
图7. 全文总结
参考文献
Mayers JR, Varon J, Zhou RR, et al. A metabolomics pipeline highlights microbial metabolism in bloodstream infections. Cell. 2024.
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