提升CUT&Tag技能，就不怕卷单细胞ChIP技术了

要问DNA-蛋白质互作技术谁最火？就不得不提CUT&Tag技术了！CUT&Tag技术自2019年问世以来，不断突破创新，从最初只能做组蛋白修饰，到现在越来越多转录因子见刊，甚至各种R-loop、G4结构的研究也被大量报道。更不要说单细胞技术爆火的现在，scCUT&Tag技术中，各种动物、细胞以及植物的文章见刊，并且CUT&Tag技术还衍生出了多靶标CUT&Tag，实现一个细胞，多个靶标的研究。

CUT&Tag技术发展历程

2019年4月首次发表

2020年大量组蛋白修饰、少量转录因子研究见刊

2021年大量转录因子研究见刊

2021年1月 scCUT&tag在动物应用方向研究见刊

2021年12月 scCUT&tag在植物应用研究见刊

2022年3月 scCUT&tag +scRNA-seq单细胞多组学联合应用见刊

2022年3月 CUT&Tag2for1技术推出

2022年12月 nano-CUT&Tag推出

更多应用持续更新……

最近经常听到单细胞ChIP技术，小翌立马查阅资料去一探究竟，结果发现还是换汤不换药，这个单细胞ChIP技术不就是咱们scCUT&Tag么？

为了帮助大家提升CUT&Tag实验技能，小翌整理了之前的一些CUT&Tag知识，同时将CUT&Tag实验的甲醛交联方案和CUT&Tag-qPCR方案一起汇总，希望大家进一步提升CUT&Tag技能，后续如果也想尝试单细胞ChIP，或者是已经在做单细胞ChIP，咱们也能更得心应手。

CUT&Tag甲醛交联方案

1.对于细胞样本，将甲醛溶液加入细胞培养皿中，使甲醛终浓度为0.1%，室温条件下，摇床上交联2-5 min(若是目的蛋白表达水平过低可以适当延长交联时间到10 min) ，交联结束后，立即加入甘氨酸到培养皿中（终浓度0.1 M），摇床继续摇15 min以终止交联，然后进行后续的细胞捕获（对于部分弱结合的转录因子，可将甲醛调为0.2%）;

2.对于组织样本，将组织用剪刀剪成小块后加预冷的PBS（含1%BSA），加入甲醛溶液使甲醛终浓度为0.1%，室温摇床上摇2-5 min(若是目的蛋白表达水平过低可以适当延长交联时间到10 min) ，交联结束后，立即加入甘氨酸到培养皿中（终浓度0.1 M），摇床继续摇15 min以终止交联，之后，用组织匀浆器匀浆，将组织匀浆后的溶液过细胞筛以获取细胞悬液，然后进行后续的细胞捕获（对于部分弱结合的转录因子，可将甲醛调为0.2%）。

【注】

A：在CUT&Tag实验开始前，我们需要确定实验方案。随着CUT&Tag技术的发展,科学家们发现有些目标蛋白质在研究时，轻微甲醛交联效果更好。之后，更多的研究表明，使用CUT&Tag技术研究不同蛋白时，所需的实验条件也不一样。做组蛋白修饰、强结合的转录因子(如CTCF、RNA polll等)无需甲醛交联。而一些弱结合的转录因子或转录辅因子则需要甲醛交联，并且甲醛交联的强度也不一样。常规的轻微甲醛交联条件为0.1%甲醛室温交联2 min，之后用0.1 M甘氨酸终止交联。

B：若在实验时，有添加甲醛进行轻微交联，那么后续加终止buffer后，步骤稍微有调整哦！甲醛交联后，蛋白酶K消化步骤调整为：向每个样品中加入2 μL 15× Terminate Solution、1 μL DNA Spike-in mix和1 μL 30× Proteinase K（此时磁珠会板结）（若样品较多，可一起提前配制）。全速涡旋样品约10 sec，混匀后瞬离，将样品置于PCR仪，55 ºC消化2 h (热盖不低于70 ºC)或者37 ºC过夜。

CUT&Tag-qPCR方案

目前做CUT&Tag-qPCR时，有两种，一种是蛋白酶K消化和gDNA提取后直接qPCR实验，一种是完成建库后进行qPCR。这两种方式都有文献可参考。目前翌圣更推荐完成建库后进行qPCR实验。

qPCR 定量检测

qPCR试剂以翌圣的Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat#11184）为例。

反应体系（推荐冰上配制）

【注】

使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

b) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

c) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

d) 反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染。

反应程序

【注】

快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。

a) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

b) 荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

c) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；

Ct值小于10时，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；

Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲线：

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