1. 培养基的配制
第一次亚克隆，一般用HT完全培养基（含1×HT和20%胎牛血清的1640完全培养基），配制方法：20%胎牛血清+1%双抗(链霉素和青霉素，100×)+1/50体积的HT（50×）+1640不完全培养基。
2. 饲养细胞的准备
参照以上“4.饲养细胞/融合细胞准备”相关内容，最后将细胞重悬在HT完全培养基，备用。对于初学者建议选用杂交瘤培养添加剂（Frdbio,MCC0014）。
3. 细胞亚克隆
细胞亚克隆的目的是为了得到单个细胞（单克隆）分裂生长的细胞，这样所产生的抗体的性质都是一样的。一般采用有限稀释法，当然也可以考虑半固体培养基法。半固体培养基法可参照以上《杂交瘤细胞铺板培养中》的《半固体培养基培养》相关内容，本节内容主要介绍有限稀释法。
教科书和参考资料一般是建议将细胞稀释到平均每孔0.8个细胞，此时含有单个细胞的孔的概率最高；但是，这个方法并不科学，原因是不同实验体系对细胞生长的支持并不一样，并不是每孔单细胞都可以顺利存活成长起来，所以，每个实验室需要根据自己的实验体系测试最佳的单孔平均细胞个数。
阳性细胞稀释到平均每孔某个确定的个数，分种到含有饲养细胞的96孔板里，置于5% CO2 37℃细胞培养箱中培养，5天左右观察，选取只含有单集落细胞孔进行上清检测；如果单集落孔达到50%以上，且所选择的单集落孔检测的结果为100%阳性即可认为此细胞为单克隆细胞株，以杂交瘤细胞原始孔编号为其命名。将亚克隆后的细胞株放大，可进行腹水生产。如果检测结果达不到100%阳性则需要从本次亚克隆所获得细胞株中阳性值最高的孔继续进行第二次亚克隆。
亚克隆得到的细胞株需要进行多种实验条件的验证，ELISA验证只能算是筛选；常见的实验验证条件有免疫印迹（Western Blot），免疫荧光(IF)、免疫组化(IHC）等等，如果要进行下游产品开发还需要进行进一步实验。