上期，我们为大家介绍了基因干扰的干货知识以及维真特色shRNA干扰服务，小伙伴们有没有收获满满？然而，实践才是检验真理的金标准，因此本期小V为大家整理了一些 维真生物 shRNA产品和服务成功应用的案例，和大家共同探讨和学习！
01. 4in1 shRNA克隆案例分享
胃癌是侵袭性极强的恶性肿瘤之一，早期诊断率低，转移率高。尽管胃癌在治疗方面已经取得了一定的进展，但为了寻求更佳的治疗手段，需要更好地了解其潜在发病机制和新的治疗靶点。驱动蛋白超家族23基因（KIF23），在细胞质分离、轴突生长等多种细胞过程中发挥重要作用。目前，KIF23已被发现在多种肿瘤组织和细胞中高表达，提示KIF23与肿瘤发生有潜在的联系。在本篇研究，作者发现KIF23的表达与胃癌的不良预后相关，且与肿瘤分期（pTNM）有关。体外实验证明，KIF23的缺失对胃癌细胞的增殖有明显的抑制作用。此外，KIF23基因敲除可显著抑制小鼠胃癌细胞的增殖，并显著下调肿瘤细胞增殖因子Ki67和PCNA的表达。综上所述，这些数据表明KIF23可能是胃癌的一个潜在治疗靶点。
产品：维真生物 4in1 shKIF23 质粒
转染细胞：胃癌细胞系MGC-803和SGC-7901
KIF23 在人胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中低表达(qPCR和WB)
02. shRNA腺病毒案例分享
据报道，跨膜蛋白173（TMEM173）重组蛋白能参与内质网应激、炎症和免疫过程，这些过程都与心肌肥大密切相关。TMEM173和自噬之间有密切而复杂的联系，但它在自噬中的具体作用还有待进一步研究。在本文中，作者发现与野生型C57BL/6小鼠相比，Tmem173基因敲除（KO）的小鼠在横向主动脉缩窄（TAC）6周后表现出更严重的肥大、纤维化、炎性浸润和心脏功能障碍。透射电镜和蛋白质水平显示KO小鼠心肌自噬小体降解受到抑制。另外，苯肾上腺素处理的乳鼠心肌细胞的体外实验表明，Tmem173基因的丰度与Lc3-Ⅱ的丰度和反映自噬体降解能力的红色和黄色荧光点数呈负相关。这些结果表明，TMEM173可以改善自噬通量，并对压力超负荷所致的心肌肥厚具有保护作用，暗示其可能成为未来治疗心肌肥厚的潜在靶点。
产品：维真生物 Ad‐shRNA‐Tmem173
感染细胞：乳鼠心肌细胞 NRCMs
MOI：20
Tmem173下调对体外PE诱导的心肌细胞肥大的影响
03. 4in1 shRNA腺病毒案例分享
破骨细胞是从单核/巨噬细胞系分化来的多核细胞，受核因子-κB受体激活因子配体( RANKL)调控，行使骨吸收的功能。过度的骨吸收会导致骨转换失衡，并引发各种骨疾病。因此，探索破骨细胞骨吸收的新靶点或机制，可能有助于提高破骨细胞引起的骨疾病的治疗效果，减少疾病副作用。先前研究已证明RANKL诱导的破骨细胞形成过程中，糖酵解代谢增强，但其发挥的具体作用尚不清楚。6-磷酸果糖-2激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3 (PFKFB3)，是糖酵解的重要调节因子，华中科技大学同济医学院的研究人员通过对PFKFB3进行遗传和药理抑制，并利用去卵巢小鼠模型研究了PFKFB3在破骨细胞分化中及破骨细胞相关疾病发病机制中的作用，揭示了靶向PFKFB3阻断糖酵解是一种潜在的治疗破骨细胞相关疾病的策略。
产品： 维真生物 murine PFKFB3 Ad-4in1 shRNA
感染细胞：骨髓源性巨噬细胞BMMs
MOI：50
敲低PFKFB3的表达可降低成熟破骨细胞的数量大小且损坏F-肌动蛋白环
04. 4in1 shRNA慢病毒案例分享
雄激素受体AR在前列腺癌的发展和恶化中至关重要，通过前期研究作者发现，去泛素化酶-泛素特异性蛋白酶14（USP14）可以通过其去泛素化酶的活性稳定AR，促进前列腺癌的生长。近期，研究人员发现，AR在乳腺癌的发生发展中也能发挥关键作用。本篇文章主要探究去泛素化酶USP14对雄激素受体阳性乳腺癌发生发展的影响，该研究结果对当下以USP14为靶标治疗AR乳腺癌新策略的观点进行了有力支持。研究者通过shRNA慢病毒，敲低USP14的表达，然后检测雄激素受体AR的表达，泛素化水平和降解速率，判定USP14是雄激素受体AR的去泛素化酶，稳定AR的水平，并通过进一步的的AR补救实验判定USP14敲低或者抑制引起的乳腺癌细胞的生长抑制依赖于AR的水平。
产品： 维真生物 pLent-4in1 shUSP14-GFP
感染细胞：乳腺癌细胞株
用途：构建稳转细胞株
在多种乳腺癌细胞中敲低USP14的表达
05. mir30-based shRNA AAV案例分享
恐惧和压抑等情绪是我们生活中的正常生理和心理反应，但长期频繁的急性情绪反应（又称慢性应激）不仅会使脑神经可塑性发生变化，增加抑郁和焦虑风险，还会引起外周血T淋巴细胞功能障碍，造成免疫系统紊乱。目前的研究已经发现了多种免疫因子在心理疾病中的生理功能，然而，外周血T淋巴细胞在慢性应激诱导焦虑中的作用及其调控机制仍有待探索。浙江大学和东南大学研究团队在《CELL》联合发文，揭示了CD4+ T细胞嘌呤合成代谢紊乱与慢性应激诱导的焦虑行为之间的相互关联，该成果对加深神经发育、精神疾病与免疫生理功能之间联系的理解，对了解抑郁症和焦虑症的发病机制并开发新的治疗药物具有重要意义。
维真生物病毒产品：
①AAV9-GFAP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1)
②AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1)
③AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(scramble)
注射部位：左侧杏仁核
注射量：1x10E11 vg/mouse
流式细胞术分析显示AAV病毒在左杏仁核少突胶质细胞中强烈、特异性表达
06. 诱导性shRNA AAV案例分享
抑郁症是一种慢性复发性疾病，患病率呈逐年上升的趋势，已成为世界疾病排行榜的第四大疾病。研究表明，炎症和抑郁症发生密切相关，长期精神压力应激会使伏隔核(NAc)脑区紧密连接蛋白Cldn5（血脑屏障BBB的关键组分）表达下调，导致血脑屏障受损并促进抑郁样行为。然而，血脑屏障损害为何仅出现在NAc，应激易感小鼠NAc脑区中紧密连接蛋白表达下调的分子机制尚不清楚。
伏隔核神经元cAMP调控血脑屏障完整性和抑郁敏感性
中国药科大学的研究人员通过代谢组学分析等手段对压力应激诱导抑郁的小鼠模型进行研究，发现cAMP在NAC中特异性降低，并与抑郁程度呈正相关，在NAC中补充cAMP可以改善BBB的完整性和抑郁样行为。RNA-Seq分析发现，cAMP下降主要是因为其合成酶Adcy5受抑制，且此过程只发生在神经元细胞中。通过降低NAc中Adcy5的表达，内源性调节神经元内cAMP合成，可调节对社会应激的敏感性。此外，NAc脑区cAMP不足降低了胞外基质蛋白reelin的表达，外源补充后促进了BBB完整性，并改善了抑郁样行为。上述结果表明，神经元cAMP可能通过Reelin介导的细胞外基质信号调节NAC血脑屏障完整性的分子机制，为抑郁症的防治提供了新思路。
维真生物病毒产品：
①Dox 诱导性AAV2/9-shRNA-Adcy5（2.02x10E12 vg/mL）
②AAV2/9-shRNA（2.38x10E12 vg/mL）
注射部位：双侧伏隔核
注射方式：立体定向注射
注射量：每侧0.5 µL
注射速率：0.1µL/min
伏隔核内神经元CAMP合成内源性调节后的行为变化
