自然杀伤细胞(NK)作为先天免疫细胞，具有直接杀死恶性细胞的能力，对比基于T细胞的免疫治疗，NK细胞不存在移植物抗宿主病(GVHD)、细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性等风险，因此NK细胞被认为是具有巨大潜力的免疫治疗工具。目前NK细胞应用于临床的最大阻碍就是如何高效扩增NK细胞，今天我们通过一篇研究文章解析来了解NK细胞扩增技术的newest进展。
正常外周血中NK细胞仅占淋巴细胞的5%-15%，同时NK细胞的产生会随年龄增长和新陈代谢减缓而减少。但是NK细胞的一大优势在于他的来源很广泛，如外周血单核细胞(PBMCs)、脐带血(UCB)细胞、诱导多能干细胞(iPSCs)、NK细胞系等均可在体外生成NK细胞。文章以此为切入点将不同来源的NK细胞进行分类，针对每一种不同的细胞来源提出不同的扩增方案，同时详细的介绍了科学家如何用newest的基因编辑理论和技术去改造NK细胞，及影响其细胞功能的细胞因子，Maximum extent的开发NK细胞的免疫功能。
免疫治疗中NK细胞的来源和增强能力的策略。各种类型的细胞，包括PBMC、UCB、iPSCs和NK细胞系，已经被用作产生NK细胞用于免疫治疗的来源。基因修饰技术、分化方案和新的合成试剂已被开发用于改善NK细胞的功能
iPSC或胚胎干细胞(ESC)衍生的NK细胞因其具有同质性、高毒性的NK细胞产物而受到科学界的广泛关注。PBMC因其易于收集、易于体外扩增、无毒副作用等优点，成为NK细胞的主要来源之一，因此着重介绍。
NK 细胞系或诱导多能干细胞 (iPSC)，分离的 NK 细胞在存在或不存在的情况下利用细胞因子刺激进行扩增的饲养细胞
研究发现使用多细胞因子联合培养比单一细胞因子培养更能有效地诱导NK细胞增殖，IL-2和IL-18联用的组合扩增效果最理想。而IL-12、IL-15和IL-18的组合可以预先激活NK细胞，赋予NK细胞记忆表型。想要进一步促进NK细胞增殖的话可以加入OK432，科学家也开始尝试使用被辐射过的肿瘤细胞系和肿瘤细胞膜颗粒来扩增NK细胞，但是这些方案存在较大的风险，毕竟辐射的效果和强度并不是完全可控的，开发成熟的培养系统是目前发展的主流方向。
IL-12、IL-15 和 IL-18证明可诱导细胞因子记忆
换一个角度，我们也可以从NK细胞的本身着手，得益于飞跃式发展的基因编辑技术，我们可以人为干预基因表达，通过修饰与NK细胞代谢和复制相关的基因，可以延长NK细胞的活跃期。有科研小组利用 CRISPR-CAS9技术删除了NK细胞的CISH基因；使用逆转录病毒细胞转染NK细胞来表达TERT基因，这样调整CISH和TERT蛋白的含量可以有效的增强抗肿瘤活性。
从人 iPSC 获得克隆 CISH-/- iPSC-NK 细胞的示意图。在 WT iPSC 中进行 CRISPR/Cas9 介导的 CISH KO，在克隆水平鉴定 CISH-/-iPSC。克隆扩增后，CISH-/- iPSC 通过造血分化为 CD34+ 造血祖细胞，然后使用先前报道的方法通过 NK 细胞分化为 CISH-/- iPSC-NK 细胞
攻克了NK细胞产量和细胞毒性的难题后，我们需要考虑如何将NK细胞大规模的应用于临床操作。根据前文的介绍，NK细胞的操作和生产过程需要频繁补充新鲜培养基、细胞因子和生长因子，以确保NK细胞在最佳环境中生长，这无疑增加了引入外部污染物的风险，同时也要考虑生产成本的问题，开发完全自动化、封闭的NK细胞生产系统是必然之举。
目前用于大规模生产NK细胞的封闭培养系统有渗透性细胞培养瓶G-Rex (Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN, USA)和波式生物反应器(GE Healthcare Life Sciences, Chicago, USA)。这些培养系统不需要反复更换液体或操作细胞，大大降低了污染的风险。此外，封闭的环境和培养瓶的自动化会产生更多活跃的NK细胞。
智能生产操作系统流程（1）开始细胞加工和储存，包括开始细胞选择、分离和冷冻保存；（2） 扩展和功能改进，包括NK细胞培养、基因工程、质量控制系统和包装；（3） 储存时，产品被冷冻保存。在制造过程中，质量控制系统涉及自动取样、测试结果评估和智能调整，生产过程与监控系统相互作用。样品、测试和过程运行参数的所有信息均由监控系统监控。
NK细胞的丰富来源给了科学家更多的选择，开发具有针对性的扩增方案可以极大提高NK细胞的增值效率。基因编辑可以从根本上解决NK细胞因为缺乏体内记忆性而作用时间较短的弊端。全自动化封闭生产系统加速了NK细胞大规模投入临床使用的步伐。
对比热门的T细胞免疫治疗，NK细胞在治疗残余肿瘤和控制复发方面具有不可替代的优势，我们可以预测基于NK细胞的免疫治疗在未来会发挥巨大的临床作用，为病人们带去治愈的希望。
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解读文献：
[1] Fang, F., Xie, S., Chen, M. et al.Advances in NK cell production. Cell Mol lmmunol 19,460–481 (2022). https://doi.org/10.1038/s41423-021-00808-3.
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