慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。特点如下：
1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
慢病毒包装实验步骤
一、Day1: 10cmdish聚合度90%的HEK293T（每盘大约6x107）细胞按1：1比例传盘至15cmdish，第二天细胞达到聚合度90%-95%（每盘大约1.5x108），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。
二、Day2:
1、转染前2-3个小时换液（含10%FBS，1mM/L不需要加入丁酸钠？加入的浓度？)
2、按照以下比例配置转染试剂：
| Mix 1 | 体积 ul | Mix 2 | |
| DMEM（无FBS） | 1000 | DMEM（无FBS） | 1000 |
| PEI | 190ul (1ug/ul) | 目的基因质粒 | 25 ug |
| PMD2G | 7.5ug | ||
| PSPAX2 | 15ug |
Mix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm细胞培养皿中。（细胞达到聚合度90%，细胞过少会影响转染效率）
三、Day3: 6h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。
四、Day5:72h观察细胞状态并拍照。收取上清培养基，过0.45um滤膜，上清培养基加入超速离心管中，配平后离心，25000r，4℃离心1.5h。弃上清，用1ml病毒保存液回溶混匀溶解过夜。
五、Day6：收集病毒分装、孔稀释测滴度。
| 取5ul病毒原液加入到45ulDMEM中，混匀后取5ul加入到45ulDMEM中，重复6次；分别做两组重复 | |||||||
| 病毒原液=A | 45ulDMEM +5ulA=B1 | 45ulDMEM +5ulB=C1 | 45ulDMEM +5ulC=D1 | 45ulDMEM +5ulD=E1 | 45ulDMEM +5ulE=F1 | 45ulDMEM +5ulF=G1 | 45ulDMEM +5ulG=H1 |
| 病毒原液=A | 45ulDMEM +5ul病毒=B2 | 45ulDMEM +5ulB=C2 | 45ulDMEM +5ulC=D2 | 45ulDMEM +5ulD=E2 | 45ulDMEM +5ulE=F2 | 45ulDMEM +5ulF=G2 | 45ulDMEM +5ulG=H2 |
| 将这7个混合液和病毒原液分别取10ul加入到96孔293细胞中（ 每孔约5000个细胞），72H拍照 | |||||||
| 10ulA | 10ulB1 | 10ulC1 | 10ulD1 | 10ulE1 | 10ulF1 | 10ulG1 | 10ulH1 |
| 10ulB2 | 10ulC2 | 10ulD2 | 10ulE2 | 10ulF2 | 10ulG2 | 10ulH2 | |
| 102 | 103 | 104 | 105 | 106(NE1,NE2个带荧光细胞） | 107(MF1,MF2个带荧光细胞） | 108 | 109 |
| 计算方法,对能观察到荧光的后两个孔进行计数，两组重复取平均值 [(NE1+NE2)÷10+MF1+MF2]÷4×107 | |||||||
慢病毒感染细胞的实验步骤
1、铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜
2、感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS