发表期刊：Nature Communications
发表日期：2021年9月13日
影响因子：14.911
研究方法：RIP-seq、RNA-seq、miRNA-seq、RNA-pull down
文章链接：Hypoxia regulatesoverall mRNA homeostasis by inducing Met1-linked linear ubiquitination of AGO2 incancer cells
文章概要
缺氧是人类实体肿瘤最突出的特征，促进缺氧诱导因子及其下游基因的激活。然而，缺氧是否以及如何调节mRNA的整体稳态尚不清楚。在这里，作者发现缺氧抑制癌细胞中整体mRNA的衰变。机制上，缺氧诱导AGO2与线性泛素链组装复合物LUBAC相互作用，进而催化AGO2发生M1型线性泛素化(M1-Ubi)，AGO2发生M1-Ubi修饰后抑制miRNA介导的基因沉默。此外，结合RIP-seq对AGO2相关mRNA转录组以及RNA-seq对mRNA转录组的分析，证实AGO2-M1-Ubi干扰miRNA靶mRNA向AGO2招募，从而促进了整体mRNA的积累。通过这一机制，肿瘤细胞短期缺氧可维持整体mRNA水平，增强耐受性，而长期缺氧可严重改变整个基因表达谱，推动细胞恶性发展。综上，该研究发现了低氧诱导的AGO2蛋白M1型线性泛素化修饰能够调控整体mRNA稳态平衡，从新的角度揭示了肿瘤细胞低氧适应的分子机理。
研究思路
研究内容
一、缺氧破坏miRNA靶mRNA装载到AGO2并抑制mRNA衰变
为了研究缺氧调节mRNA装载到AGO2蛋白上的作用，作者使用稳定表达Flag- AGO2的HeLa细胞对AGO2进行RIP-seq。分别在常氧和缺氧条件下处理24 h，发现缺氧显著降低了mRNA转录本与AGO2的相互作用。miRNA靶mRNA招募到AGO2进行翻译抑制或衰变是通过miRISC2介导的。为了验证缺氧下miRNA谱的变化是否导致了AGO2中mRNA载量的下降进行了miRNA-seq，结果显示，这些miRNA表达并没有变化。此外，通过RNA-pull down实验，同样显示缺氧降低了AGO2与miRNA靶mRNA 的结合。因此，推测缺氧抑制miRNA靶mRNA装载到AGO2上。为了进一步验证这一点，作者分析了缺氧条件下AGO2与前10个无差异miRNA靶mRNA之间的结合，发现缺氧显著减弱了AGO2与靶点之间的互作。这些结果表明，缺氧抑制了miRNA靶mRNA装载到AGO2蛋白上。
为了探究缺氧抑制miRNA靶mRNA与AGO2的结合是否会抑制mRNA的衰变，作者对mRNA进行了RNA-Seq，发现缺氧显著增加了前10个无差异miRNA靶点的丰度。此外，通过let-7 miRISC荧光素酶报告基因分析，结果显示缺氧应激显著抑制了let-7 miRISC的活性。并且将let-7a miRNA和阴性对照转染到稳定表达GFP-4xlet-7a- BS的293T细胞，发现缺氧时再过表达let-7a miRNA可恢复GFP mRNA的衰变。综上所述，缺氧破坏miRNA靶mRNA与AGO2的结合，从而抑制mRNA的衰变。
二、缺氧促进AGO2与LUBAC的相互作用
为了研究其分子机制，通过COIP-MS分析了缺氧条件下AGO2的互作蛋白。发现AGO2与线性泛素链组装复合物LUBAC的两个蛋白HOIL-1L和HOIP结合。为了进一步验证此结果，通过CO-IP实验检测内、外源这些蛋白的结合，结果显示AGO2确实与HOIP和HOIL-1L相互作用，此外，AGO2与LUBAC的另一组分SHARPIN蛋白也有较弱的结合。更重要的是，缺氧大大增加了内源性AGO2与HOIL-1L和HOIP的相互作用。通过一系列敲低、CO-IP以及质粒片段化实验，发现缺氧诱导了HOIL-1L的表达，增加了HOIL-1L启动子的活性，从而增加了LUBAC与AGO2的相互作用；并且HOIP的UBA域和HOIL-1L的UBL域分别负责与AGO2结合。综上所述， AGO2与LUBAC有相互作用。
三、LUBAC介导AGO2的M1型线性泛素化修饰
LUBAC是唯一催化其底物形成线性多泛素链的酶，因此作者想探究LUBAC是否介导了AGO2的线性泛素化。首先，通过共转染AGO2和ubiquitin-7KR(7个赖氨酸全部突变为精氨酸，使得多泛素链的形成是由第一个蛋氨酸(Met1)而不是赖氨酸残基连接的线性多泛素化的独特形式)并进行CO-IP实验，发现AGO2发生了线性泛素化且过表达ubiquitin-7KR后可显著增加这种修饰。由于AGO2与LUBAC相互作用，作者推测LUBAC是AGO2 M1-Ubi修饰的E3连接酶。为了证实这一点， M1-SUB（特异性M1型泛素结合物）下拉实验以及GST-pull down发现LUBAC增加了内外源AGO2的M1-Ubi修饰。此外，当HOIP和HOIL-1L在HeLa细胞中稳定过表达时， AGO2的M1-Ubi修饰增强。这些结果表明AGO2是LUBAC E3连接酶的线性多泛素化底物。HOIP是LUBAC最关键的组成部分，通过shRNA稳定敲除HOIP可显著降低AGO2的M1-Ubi。综上所述，LUBAC催化AGO2的M1-Ubi修饰。
四、OTULIN是AGO2的一种去线性泛素酶且K820是AGO2的M1-Ubi位点之一
已知OTULIN、CYLD和A20通过不同的机制负调控线性泛素链组装。OTULIN可拮抗LUBAC信号通路高度特异性水解线性多泛素链。因此作者进一步研究了OTULIN是否是AGO2的去线性泛素酶。通过IP和M1-SUB下拉实验发现OTULIN显著降低LUBAC介导的AGO2 M1-Ubi修饰，相反，敲低OTULIN可以极大地增强AGO2 M1-Ubi修饰。此外，通过突变实验发现OTULIN-C129和W96参与了线性泛素链结合。因此，上述结果表明OTULIN是AGO2的一种去线性泛素酶。为了进一步鉴定AGO2的M1-Ubi位点，作者生成了AGO2功能域结构体，M1-SUB下拉实验显示M1-Ubi位点主要分布在AGO2的小RNA结合域PAZ和MID以及核酸酶活性域PIWI，提示AGO2在多个赖氨酸处被线性泛素化。随后对这些赖氨酸生成了点突变或组合突变，发现K820R可以减少约一半的AGO2 M1-Ubi。且缺氧和CoCl2都强烈增强了AGO2 M1-Ubi修饰。
miRNA与AGO2和TNRC6/GW182组装成miRNA诱导沉默复合体(miRISC)，直接诱导靶mRNA转录后沉默。为了研究HOIP和HOIL-1L是否被招募到miRISC中，通过CO-IP实验发现TNRC6A/GW182也与HOIL-1L结合。此外，荧光免疫染色显示HOIP和HOIL-1L与AGO2/TNRC6C miRISC发生共定位，且缺氧条件下它们之间的共定位更强。此外，作者列出了这些蛋白之间相互共定位的皮尔森相关系数(PCC)。综上所述，HOIP和HOIL-1L与miRISC具有共定位，且miRISC与HOIL-1L的相互作用远远大于与HOIP的相互作用。
六、 AGO2的M1-Ubi修饰破坏miRISC活性
为了确定AGO2的M1-Ubi是否影响miRNA引导的基因沉默，将报告基因psiCHECK2-4xlet-7a-BS、Myc-AGO2、HOIP/HOIL-1L或HOIP突变体/HOIL-1L共转染293T细胞，发现AGO2显著增加了miRISC的活性，HOIP/HOIL-1L可显著降低其活性，提示AGO2的M1-Ubi可能抑制了miRNA引导的基因沉默。且OTULIN可以拮抗LUBAC对miRISC活性抑制的情况，抑制或敲除HOIP均大大增加了AGO2介导的miRISC的基因沉默活性。为了进一步支持这一观点，将GFP-4xlet-7a-BS、HOIP siRNA(含或不含HA-AGO2)共转染HeLa细胞。显示GFP的表达水平受到了AGO2的抑制，当敲除HOIP时，这种作用更强。综上所述，这些数据表明AGO2的M1-Ubi修饰抑制了miRNA介导的基因沉默。
七、AGO2的M1-Ubi阻碍其对miRNA靶mRNA的招募
综合以上结果，作者推测AGO2的M1-Ubi扰乱miRISC活性的机制可能是靶mRNA招募到AGO2的延迟。通过对两种细胞株：HeLa-Flag-AGO2细胞过表达HOIP/HOIL-1L，HeLa细胞敲低HOIP，进行miRNA-seq和RIP-seq，分析发现miRNA发生部分改变，以及过表达LUBAC减少与AGO2结合的mRNA转录本，而抑制HOIP则显著增加了mRNA转录本与AGO2的相互作用。值得注意的是，大多数与AGO2结合的mRNA转录本在HOIP和HOIL-1L过表达细胞中显著减少，同时在HOIP敲除细胞中增加。此外，通过靶mRNA下拉、GST-MS2下拉和体外靶mRNA结合试验来检测let-7a靶mRNA与AGO2的结合。发现过表达HOIP/ HOIL-1L抑制AGO2与let-7a靶向mRNA HMGA2的相互作用，敲除HOIP则增加了AGO2对miRNA靶mRNA的招募。因此，上述结果表明AGO2的M1-Ubi阻碍了miRNA靶 mRNA装载到AGO2/miRISC复合物上。
八、AGO2的M1-Ubi整体促进mRNA积累
接下来，探究AGO2的M1-Ubi是否调控mRNA的积累。通过RNA-seq发现过表达HOIP/HOIL-1L后表达上调的mRNA是下调的2.1倍，LUBAC过表达显著增加了AGO2靶mRNA的丰度，表明AGO2的M1-Ubi增加了AGO2结合mRNA的积累。作者推测AGO2的M1-Ubi可能影响mRNA转录本的半衰期，发现过表达HOIP和HOIL- 1L时，半衰期较长的mRNA转录本丰度明显高于半衰期较短的mRNA转录本，且进一步用放线霉素D处理后，显示抑制HOIP可大大缩短GFP mRNA的半衰期。综上所述， AGO2的M1-Ubi修饰可整体抑制mRNA衰减。此外，我们还分析了lncRNA的表达谱，发现AGO2的M1-Ubi不仅调控mRNA的水平，还调控lncRNA的水平。
九、缺氧促进临床肿瘤标本中miRNA靶mRNA的积累
为了研究缺氧诱导的AGO2 M1-Ubi促进mRNA积累是否也是临床肿瘤标本中普遍存在的现象，作者使用肺癌标本中miRNA-Seq和RNA-Seq的TCGA数据。首先，作者比较了缺氧程度相对较高的肺癌组织与正常组织中miRNAs的表达水平，发现前10位无差异miRNAs，两组间mir-146b和mir-24-2几乎没有变化。此外，通过分析肺癌样本的RNA-Seq数据，发现缺氧评分与前10位无差异miRNA靶mRNA的表达水平呈极显著正相关，而与非miRNA靶mRNA表达水平略有负相关。此外，前10个无差异miRNA靶点在高缺氧肺癌组织中的表达水平远高于低缺氧肺癌组织，但非miRNA靶点没有太大差异。综上所述，临床肿瘤标本中缺氧与miRNA靶mRNA的表达水平呈正相关。
文章小结
RNA免疫沉淀（RIP）技术介绍
01 RIP实验原理
RIP技术(RNABinding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀)，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络的有力工具。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析，结合的RNA可以通过定量PCR（RIP-pcr）或高通量测序（RIP-seq）方法来鉴定。
02 RIP-seq技术简介
这种技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP-Seq将RIP技术与高通量测序相结合，能够高通量地检测与特定蛋白结合的RNA，从而解析全转录组范围内的目标蛋白-RNA相互作用网络。云序生物是业内少数的既做前端高通量测序筛选，同时实现一站式解决功能机制的科研服务公司。在各类RNA分子研究火热的现阶段，更多科研工作者想要在通过高通量筛选到目的基因后，解决RNA的分子机制问题，云序提供的RIP和RNA pull down技术正好解决分子机制的核心技术难点。
03 RIP试剂盒
GenSeq® RNA免疫沉淀试剂盒，应用于RNA-蛋白质互作研究。通过RIP方法，可以检测与特定蛋白结合的RNA，从而为研究分子机制提供强势助力。优化过的实验流程后获得的蛋白结合RNA可以广泛应用于后续的定量RT-PCR，高通量测序以及其他检测分析。
云序生物服务优势
优势一：一站式服务，客户只需提供细胞，组织或RIP后 RNA，云序生物为您完成从样品处理，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。优势二：商业化的RIP试剂盒，RIP实验的成败是决定数据质量的关键，云序生物采用商业化RIP试剂盒，保证了RIP实验的成功率和稳定性。
优势三：严格的质控，云序生物在实验的各个关键步骤加入了一系列质控点，全程监控实验质量，确保客户得到优质的数据。
优势四：专业化的生物信息分析，云序生物具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析要求。
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