上海交通大学附属瑞金医院血液研究所赵维莅教授团队针对外周T淋巴瘤的研究。近期，该课题组应用ChIP-seq联合mRNA-seq分析揭示了联用西达本胺和地西他滨对组蛋白修饰基因突变的外周T淋巴瘤的作用机制。该研究成果于2018年1月发表在血液科权威杂志《Haematologica》（影响因子7.7）上。（ChIP-seq及mRNA-seq均由云序生物提供技术服务）

研究背景:

  由于不同的形态和免疫特征，约50%的外周T淋巴瘤（PTCL）无法分类，并且呈现很差的临床表现，因此迫切需要找到可操作性的生物标志物以便临床上找到更好的治疗策略。已知表观遗传改变在肿瘤发展中起到很关键的作用。组蛋白修饰，尤其是甲基化和乙酰化，一般都会参与调控染色体的状态。在本研究中，作者首先通过靶向测序筛选到一系列组蛋白修饰相关基因的突变，接下来通过ChIP-seq和mRNA-seq进一步分析西达本胺和地西他滨联用对组蛋白修饰基因突变的外周T淋巴瘤的作用机制。

研究思路:

  首先，作者筛选到了几个关键基因的突变，比如组蛋白甲基化修饰相关的基因（KMT2D，SETD2，KMT2A和KDM6A）以及组蛋白乙酰化修饰相关的基因（EP300和CREBBP），并在125例患有PTCL患者中发现45例有59个体细胞突变。临床研究发现组蛋白修饰相关基因突变与未经化疗的患者更低的无进展生存期有关，且对组蛋白脱乙酰酶抑制剂西达本胺敏感性增加。

  作者发现组蛋白脱乙酰酶抑制剂西达本胺联用低甲基化试剂地西他滨能显著抑制EP300突变的T淋巴瘤细胞的生长以及KMT2S突变的T淋巴瘤细胞的生长。作者进一步通过ChIP-seq和mRNA-seq揭示了联用西达本胺和地西他滨对组蛋白修饰基因突变的外周T淋巴瘤的作用机制（ChIP-seq和mRNA-seq均由云序生物提供技术服务）。地西他滨可协同西达本胺增强KMT2D与转录因子PU.1相互作用，调控H3K4me相关的信号通路，并增强PTCL对西达本胺的敏感性。在KMT2D突变的移植T淋巴瘤模型中，联用西达本胺和地西他滨可显著延缓肿瘤生长，并通过KMT2D/H3K4me诱导细胞凋亡。

1. 外周T淋巴瘤突变情况统计

作者招募了239名未经治疗的PTCL患者，并对可获得的125名患者的肿瘤样本进行的靶向测序。作者在125例患者中发现，其中有60例患者一共出现91个表观遗传修饰基因的体细胞突变。大部分突变是错义突变（n=72），还有无义突变（n=10）和移码突变（n=9）。结果表明与其他肿瘤的SNV图谱相似都是更偏向于C>T/G>A突变，这与年龄和性别无关。组蛋白甲基化修饰基因突变发生在KMT2D（编码H3K4甲基化转移酶，25/125，占20%），SETD2（编码H3K36甲基化转移酶，6/125，占4.8%），KMT2A（编码H3K4甲基化转移酶，3/125，占2.4%）和KDM6A（编码H3K27去甲基化转移酶，1/125，占0.8%），并没有EZH2突变。组蛋白乙酰化修饰基因突变发生在EP300（编码H3K18乙酰化转移酶，10/125，占8%）和CREBBP（编码H3K18乙酰化转移酶，5/125，占4%）。还有其他DNA甲基化基因和染色体重构基因突变等。根据突变基因的分类，这四种很少有重叠，尤其是组蛋白甲基化修饰基因突变和组蛋白乙酰化修饰基因突变，这表明组蛋白修饰基因可能在不同的生物学过程中发挥作用。

图示：PTCL突变分类

2. 组蛋白修饰基因突变使淋巴瘤细胞对西达本胺和或地西他滨更敏感

KMT2D和EP300错义突变质粒分别转染至JurKat细胞，发现KMT2D突变会抑制H3K4me3的表达水平，但会被组蛋白脱乙酰酶抑制剂罗米地辛和西达本胺恢复。此外，EP300突变会抑制H3K18ac的表达水平，但会被组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸，亚罗里亚胺酸或罗米地辛和西达本胺恢复。在PTCL肿瘤样本中也发现KMT2D突变显著降低了核内H3K4me3的表达水平（30%），EP300/CREBBP突变也显著降低了核内H3K18ac的表达水平（17%）。有趣的是，给突变患者按每周两次口服30mg的西达本胺，有组蛋白修饰基因突变的复发患者得到完全或部分缓解。这一结果表明这些突变可能使PTCL患者对组蛋白脱乙酰酶抑制剂更敏感。

图示：组蛋白乙酰化抑制剂对KMT2D突变和EP300突变的PTCL的作用

体外实验也进一步证实了这一结论。流式细胞术证明西达本胺和地西他滨可协同诱导KME2D突变的细胞凋亡作用和G0/G1期阻滞作用。在KMT2D突变的移植T淋巴瘤模型中，联用西达本胺和地西他滨还能显著延缓肿瘤生长。体内外实验一致表明联用西达本胺和地西他滨比单用药物作用更显著。

图示：西达本胺和地西他滨对KMT2D突变和EP300突变的PTCL的作用

3.Chip-seq联合mRNA-seq揭示作用机制

  为了搞清楚KMT2D-H3K4me3 DNA结合的靶基因，作者利用ChIP-seq在单用西达本胺或联用地西他滨的KMT2D突变细胞中检测H3K4me3结合的靶基因。Venn图表明联合用药和单用药物中，H3K4me3结合的启动子区域有显著的非重叠区。有趣的是，只有联用西达本胺和地西他滨才能影响H3K4me3结合的基因启动子表达水平，这一结合域的motif富集在与PU.1结合的区域（激活骨髓或B淋巴细胞的基因表达的转录因子）。mRNA-seq也表明与未处理组和单药处理组相比，联合用药参与多种癌症信号通路的调控，包括凋亡，细胞周期调控，细胞粘附和转录调控，而PU.1也参与癌症信号通路和转录调控。作者进一步对联合用药组mRNA-seq和ChIP-seq中重叠的基因进行GSEA分析，结果发现联合用药使MAPK通路去活化，p-ERK也随之上调。

图示：ChIP-seq和mRNA-seq揭示西达本胺和地西他滨对KMT2D突变和EP300突变的PTCL的作用机制

参考文献:Histone modifier gene mutations in peripheral T-cell lymphoma not otherwise specified.

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