在合理区间内，Ct值小，感觉美滋滋，但Ct值大的时候，可能就难受了≧ ﹏ ≦

今天小翌就给大家分享一下如何应对Ct值偏大的问题~

Ct值，即循环阈值（Cycle Threshold），是指荧光定量PCR实验中荧光信号首次超过背景噪音水平时的循环次数，是最重要的关键参数，可用于分析基因表达差异、计算基因拷贝数或者实验质量控制等等。

从图表上我们可以看到的是荧光阈值和扩增曲线交点的横坐标即为Ct值。其中出现的荧光阈值一般是基线的标准差的10倍，在实际操作中也可以手动调节。

而Ct值与模板量、产物量之间的关系为：

扩增产物量Xn=起始模板量X0×（1+扩增效率En）循环个数n

其中En表示的是扩增效率。当扩增产物量增长到一定量级后，所发出的荧光信号等于荧光阈值，此时的循环个数则为Ct值。由计算方式可以了解到，Ct值与起始模板的对数存在线性关系，当扩增产物量为定值时，起始模板量越大，Ct值越小；起始模板量越小，Ct值越大。

但是小伙伴们要注意，Ct值不是恒定不变的，不同的样本、不同的仪器会对该数据有一定的影响，有时即使是相同的样品在相同的仪器上重复2-3遍，Ct值也会存在差异。

 头疼的问题 为什么会出现Ct值偏大的现象？

Ct值的范围通常在15-35之间。当Ct值小于15，则认为在基线期扩增范围内，未达到荧光阈值。当Ct值大于35时，不适宜用于定量，仅能做定性判断。但是有不少小伙伴表示，Ct值在30以上心里就很难受了，数据使起来不痛快，为什么会出现大的Ct值呢？

上文中有提到关系等式：

扩增产物量Xn=起始模板量X0×（1+扩增效率En）循环个数n

可以发现要达到一定的扩增产物量，Ct值同起始模板量和扩增效率En有一定的关系。

 >起始模板量对于Ct值的影响  

不同的小伙伴对于起始模板的投入量有不同的选择，例如选择将cDNA原液稀释10倍后作为反应模板上机检测；直接选择cDNA原液作为反应模板上机检测；又或者在进行反转录时选用100ng RNA或1000ng RNA进行反转录。

不同的反应模板量会对Ct值造成影响，模板量越多，Ct值越小,而模板量越少，Ct值就越大。10倍的模板量差异，对应的Ct值差异约在3.3个循环数(23.33=10)。

理论情况下，模板量投入越多，Ct值会变得越小，但实际操作时要注意！小伙伴们在阅读反转录试剂或者荧光定量试剂说明书时，会发现模板投入量都会存在上限。例如反转录时模板RNA投入量不建议超过2000ng，荧光定量PCR时投入的cDNA原液体积不能超过总反应体系的1/10。切记不要盲目为了减少Ct值无限制地增加模板投入量。模板本身除了包含核酸外，还有其他潜在的上游反应残留物或抑制物，量大时会对下游反应造成一定的抑制作用。

 >扩增效率对于Ct值的影响  

理论情况下，PCR扩增将1个DNA分子变成2个DNA分子，扩增效率为100%。但实际情况下，由于PCR反应中存在抑制因素，导致扩增效率低于100%，而一些污染、非特异扩增或者引物二聚体会导致扩增效率高于100%。

通常建议选用扩增效率在90%-110%之间的反应体系进行实验测试。看到这，小伙伴会问，我如何知道我的反应体系扩增效率在多少？

通常获取真实的扩增效率需要通过预实验制作标准曲线，通过制作标准曲线，获取曲线斜率，从而换算出扩增效率。

标准曲线制作案例：以染料法荧光定量检测A基因

 01 

尽量准备高浓度的待测cDNA或质粒DNA，于室温中瞬离混匀备用。根据个人需求按照一定梯度稀释核酸样本，一般建议6-8个梯度。

02 

每个梯度做3个技术重复，配制大体系平均分配至小体系准确定会更高。期间也要注意混匀，枪头的替换和气泡排除等操作细节。

03 

上机后，荧光定量PCR仪器会根据输入的信息进行标准曲线作图和换算。

04 

观察标准曲线的斜率是否落在-3.58~-3.10之间以及相关系数R2是否≥0.98。(斜率折算成扩增效率的算法：扩增效率=10(-1/斜率)-1)

选用扩增效率在90%-110%之间的反应体系，当然，越接近100%越好。当扩增效率下降5%时，对应的Ct值大约会增加1。当扩增效率较低，在80%以下时，Ct值会明显偏大。

 >出现Ct值大，该怎么办？  

首先，小伙伴们，当Ct值偏大，尤其在30以上时，切记先不要慌，先保存好辛苦做出来的数据，冷静下来后细心分析下数据，看看数据本身是否合理且可使用！若复孔Ct值的STD＜0.2且熔解曲线单峰，则表明该数据是可靠的，可用于数据分析。

当Ct值大于30且复孔STD值＞0.2时，若其本身为低表达基因且在其他研究或发表文献中都得到验证，可尝试将技术重复从3管提升至5-6管。再次上机后，剔除其中差异较大的技术重复，选用STD值最小的复孔数据。

 对症下药，减小Ct值  01

目标模板浓度偏低

a. 通过增加反转录时RNA的投入量从而提高模板浓度，或减少cDNA模板稀释度，理论上每稀释10倍，Ct值增大3.3。

b. 模板降解的风险，选用新鲜的RNA或分装保存好的未开封RNA进行反转录获取新的cDNA。选择高产高稳的RNA提取试剂及反转录试剂。

c. 若基因本身表达丰度就很低，尝试选用高灵敏的qPCR试剂来进行荧光定量PCR。

02

扩增片段过长

a.扩增产品片段不要过长，选择产物长度在80-300bp之间的。
b.可尝试标准的三步法扩增提高长片段的扩增效率。但是要注意片段长度很长的，该方法效果不大，建议选用方法a。

03

扩增效率异常，严重偏离100%±10%

a. 做好引物设计，避免二级结构、发夹结构和错配，减少非特异扩增。

b. 确保RNA纯度达标(OD260/280、OD260/230)，减少抑制物对于反应的影响。

c. 若原采用cDNA原液作为模板，可尝试对cDNA原液进行一定比例稀释后进行分析。

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