摘要

结核病疫情依然严峻，迫切需要抗结核新药。新药临床试验是新药研发的最重要阶段，早期杀菌活性(early bactericidal activity，EBA)研究是新型抗结核药物首次用于结核病患者治疗时进行的临床研究，也是单个抗结核药物和新的联合方案临床评价的关键。为了规范开展以及更好地推进我国抗结核新药研发进程，首都医科大学附属北京胸科医院和《中国防痨杂志》编辑委员会共同组织结核病临床研究和基础研究领域的专家，经反复讨论，撰写了《抗结核新药早期杀菌活性研究方法专家共识》，就抗结核新药EBA的意义、设计、实施，以及影响因素等内容进行阐述。

结核病防治形势依然严峻，使用有效的抗结核药物是保证治疗成功的关键；现有抗结核药物不能满足临床需求，迫切需要研发抗结核新药。申请新药注册，应当进行临床试验。新药临床试验是新药研发的最重要阶段，临床试验分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。Ⅰ期临床试验是初步的临床药理学及人体安全性评价试验，目的是观察人体对于新药的耐受程度和药代动力学，为制定给药方案提供依据。Ⅱ期临床试验是治疗作用初步评价阶段，初步评价药物对目标适应证患者的治疗作用和安全性，也包括为Ⅲ期临床试验研究设计和给药剂量方案的确定提供依据。Ⅲ期临床试验是治疗作用确证阶段，进一步验证药物对目标适应证患者的治疗作用和安全性，评价利益与风险关系，最终为药物注册申请的审查提供充分的依据。Ⅳ期临床试验是新药上市后应用研究阶段。早期杀菌活性(early bactericidal activity，EBA)研究是新型抗结核药物首次用于结核病患者治疗时进行的临床研究,也是单个抗结核药物和新的联合方案临床评价的关键，属于Ⅱa期临床研究阶段的早期探索性疗效研究。随着我国抗结核新药研发进程的推进，EBA研究已在国内开展。因此，为了规范开展以及更好地推进我国抗结核新药研发进程，首都医科大学附属北京胸科医院和《中国防痨杂志》编辑委员会共同组织结核病临床研究和基础研究领域的专家，经反复讨论，撰写了《抗结核新药早期杀菌活性研究方法专家共识》。

EBA的定义和意义

EBA通常定义为治疗最初2 d内，每日每毫升痰液中活菌数[菌落形成单位(colony forming unit，CFU)]平均下降速率的对数值。除非体外数据表明新药单独使用时可能有不可接受的耐药选择风险，一般早期临床开发建议采用短期单药治疗试验。EBA反映了抗结核药物杀死痰涂片阳性肺结核患者肺内具有快速代谢活性的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)的能力。通过EBA试验定量计数每天采集的痰液中存活的MTB，测得单一药物或新治疗方案在清除新诊断的肺结核患者痰液中分枝杆菌的活性。这些试验并不是为患者提供一种确定的治疗方法，而是评估药物在较短时间内(7~14 d)的杀菌活性。EBA试验初步评价新药或新治疗方案在7~14 d整个期间的抗分枝杆菌活性。EBA研究包括监测新型抗结核药物的安全性、量化痰中MTB和药代动力学(PK)研究。

EBA研究是在相对较小的患者组中探索多个剂量药代动力学和药效学的关系。可确定试验药物的剂量反应范围，指导后续研究的剂量选择，并为后期临床开发和临床应用提供指导。EBA研究同时可以收集与安全性和耐受性相关的初步信息。EBA研究不仅包括对单药疗法的研究，还包括对新的多种药物组合的研究，以评估它们未来的适用性。尤其是药物组合的EBA研究有助于减少开发新的抗结核方案所需的时间。

EBA研究的设计

EBA的研究均为前瞻性研究，可以根据试验药物的特性确定为双盲、单盲或开放性研究。例如，以H-R-E-Z(H：异烟肼；R：利福平；E：乙胺丁醇；Z：吡嗪酰胺)为标准治疗组时，因为利福平不可避免地使尿液变色，因此，该组无法盲化。痰标本仅标有患者识别号，实验室人员在评估细菌学终点或检测药物敏感性时不知道患者的治疗分组。平行设置单药或药物组合的试验组与对照组：使用不同剂量的试验药物、对照药物或药物组合；患者被集中随机分组;选择提供高于最低抑菌浓度，且安全、耐受性良好的试验药物剂量；所有患者均需签署书面知情同意书。

患者纳入和排除标准

入组EBA试验的患者必须是免疫力正常、耐药或患肺外疾病风险低的成年肺结核患者，并且可以在完成EBA试验后开始肺结核的标准治疗。

纳入标准

1. 年龄18~60岁、体质量40~90 kg的初治痰涂片阳性患者。EBA研究并不局限于初治肺结核患者,根据试验药物的治疗对象也可以选择耐多药结核病(MDR-TB)患者。

2. 无药物或酒精滥用史。

3. HIV感染者的CD4+T淋巴细胞计数大于300/μl,并且在入组前的90d内未接受抗逆转录病毒治疗。

二、排除标准

1. 排除有严重并发症、咯血、播散性结核病或肺外结核，以及在入组前6个月内使用已知抗结核药物治疗的患者。

2. 排除糖尿病患者、心电图QT/QTc间期异常的患者、怀孕或哺乳期的患者。3. 排除接受抗逆转录病毒治疗的HIV阳性患者。

4. 排除估计隔夜痰量少于10ml的受试者。

5. 如必要，排除在入组前7d内接受单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)抑制剂、三环类抗抑郁药物或肾上腺素受体激动剂（如伪**碱或苯丙醇胺）治疗的患者（由于对MAO-A抑制的潜在风险）。

样本量和研究时间

1. 样本量:每组一般为12~15例患者。

2. 研究时间:早期的EBA研究持续2d，但现在通常延长至14d。因为重要的抗结核药物如吡嗪酰胺或贝达喹啉需要大于2d的更长时间才能显示出显著的活性。又如乙胺丁醇的剂量相关反应仅在更长的研究期间变得明显。EBA(0~2)，即一种药物在治疗的前2d杀死结核病患者痰液中活跃代谢、快速繁殖的MTB的速率，可比较新药和现有药物的活性，并评估新药的有效剂量。EBA(0~2)的结果与药物杀灭结核病灶中低代谢细菌亚群的能力关系不大，但将药物治疗期延长至5d或更长时间，将提供检测杀灭低代谢细菌亚群的机会，从而有助于评估药物杀菌活性。2005年之后，EBA研究周期延长至治疗开始后7或14 d。EBA研究延长至5 d、7 d或更长时间有几个好处：研究进行得越久，检测低杀菌活性的机会就越大；另外，较长时间的研究可以收集更多的痰标本及积累更多的数据，也有助于提高EBA研究的准确性，并允许应用更合适的统计学方法来应对可能出现的异常结果。

痰液收集

患者在整个研究期间住院。在基线和每个治疗日收集16 h隔夜痰(下午18点至第二天早上8点)。以为期14 d的EBA研究为例，在开始治疗前的2 d和开始治疗后的第1、2、3、4、5、6、7、8、10、12和14天，收集16h的隔夜痰，在第2天治疗开始前完成收集。患者将痰液收集在预先标记的宽口带螺旋盖的容器中，在收集期间痰液标本保存在4~8℃冰箱，第2天早上以4℃的温度运送到中心实验室，到达实验室后测量痰量。

细菌学检测

痰液中MTB的CFU计数

MTB定量检测所需的隔夜痰标本的最小量为10 ml。通过磁力搅拌将痰标本均质化30 min，向等体积的0.1%~1%二硫苏糖醇中加入最多10 ml痰液，混合均匀，放置20 min以获得充分消化的痰液。在无菌吐温/盐水中制备两个系列的5个10倍稀释液(1×101、1×102、1×103、1×104和1×105)。将0.1 ml的各稀释液(包括纯样品)一式四份接种到MiddleBrook7H11琼脂上，MiddleBrook7H11琼脂培养基中添加OADC增菌液(oleic acid-album in of bovine-dextrose-catalase；含油酸、牛血清蛋白、右旋糖苷、触媒)，并添加选择性标签[含有多黏菌素B(200 U/ml)、两性霉素B (10 μg/ml)、羧苄青霉素(50 μg/ml)、甲氧苄啶(20 μg/ml)]。5% 二氧化碳存在下，在37℃孵育4~6周后，以产生20~200个可见菌落的稀释度计数CFU。如果无法在20~200个可见菌落的范围内计数，则尽可能准确地计数更多的菌落。对计数取平均值，并根据稀释因子进行校正，得出每毫升痰液的CFU计数。

液体培养基中阳性报告时间(time to positivity，TTP)的测定

将5 ml痰液与等体积的N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)/NaOH(终浓度2%~3%NaOH，0.5%~0.6% NALC，1.47%柠檬酸钠)混合，涡旋振荡后在室温下液化15~20 min。混合物通过加入无菌磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中和至最终体积为45 ml。将该混合物于3000×g离心15 min。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在无菌磷酸盐缓冲液中，最终体积为2 ml。通过添加OADC增菌液和杂菌抑制剂[含多黏菌素B(6000 U)、两性霉素B(600 μg)、萘啶酸(2400 μg)、甲氧苄啶(600 μg)、阿洛西林(600 μg)]制备2个MGIT管，每管接种0.5 ml重悬沉淀标本。试管在BACTEC MGIT 960系统中于37℃孵育，终点是指示微生物生长的阳性荧光信号，该系统自动标记阳性培养物。TTP是以小时为单位进行平均和记录的。在单个试管污染的情况下，使用剩余试管的值；如果两者都被污染，则样品标记为被污染。

三、CFU计数与TTP检测的比较

在EBA研究的最初10~15年中，痰中MTB的定量应用CFU计数，全部实验过程需由人工完成，需要专门的实验室及实验设备，而且MTB的培养时间较长。在液体培养基中比在固体培养基中能够培养更广泛的分枝杆菌亚群，因此，液体培养比固体培养更敏感。另外，自动化液体培养系统减少了实验过程中的人为错误，TTP结果由培养系统自动判定，更易标准化，这使得TTP检测成为评价抗结核药物和方案早期疗效的手段之一。另外，利用TTP方法的研究有助于增加可以进行EBA研究地点的数量，从而能够在更广泛的患者中更快速地评估新药和新组合方案。

TTP检测反映的是液体培养基中MTB的代谢活性，与接种的活菌数呈反比，与结核病临床表现的严重程度和治疗结果有关。几项EBA研究将TTP法与MTB活菌CFU计数结合使用，发现TTP法与CFU计数对药物或方案的疗效排序非常相似。TTP时间长短与CFU计数高低呈负相关。两种方法之间的结果有时会出现细微的差异。在较高的细菌密度下会出现细菌结块现象，细菌团块可能具有对应于团块细胞数量的代谢活性。因此，如果将团块接种到液体培养基，TTP比从单个CFU出现所预期的阳性报告的时间要短。

统计方法和结果分析

通过从基线开始的log10CFU/ml痰的变化来评估治疗的效果，以log10CFU的平均值(±标准差)日下降幅度表示。CFU计数为0时，log10CFU计数设置为0。用于分析的人群定义为接受至少一剂研究药物的患者(意向治疗人群)。计算每个时间点最多4个CFU计数的平均值。主要疗效终点是X天内的EBA效应[EBA(0~X)]，次要疗效终点是EBA(0~2)和EBA(2~X)，以类似方式计算TTP的变化。通过回顾EBA研究文献，EBA数据多采用线性、双线性或多元线性回归来描述，这取决于哪种方法最适合数据。在试验组之间可用单因素方差分析进行比较。在某些研究中，使用配对t检验比较从第0天到第X天每个个体的TTP，或计算第0天和第X天的杀菌活性，并用配对t检验测试两个结果之间的差异，置信系数为0.95，检验水准为0.05(双侧)。

在不同时间间隔内，每个个体的抗分枝杆菌活性使用以下公式确定，并按每个治疗组进行平均：EBACFU=[ log10CFU(第x天)-log10CFU(第y天)]/(y-x)，表示为log10 CFU·ml-1·d-1减少值。TTP 计算类似，EBATTP=[TTP(第y天)-TTP(第x天)]/(y-x)。EBA研究的CFU与TTP均可能报告为阴性。如报告阴性时，TTP培养时间最长为42 d。污染的培养物应被排除在分析之外。

安全性和耐受性评估

患者在治疗期间住院，每日随访以获取生命体征，并监测不良事件，包括全血计数、凝血功能、临床生化指标检测(血清总胆红素、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、肌酸磷酸激酶和肌酐水平)、尿液分析和心电图；根据患者情况还需进行眼科评估等，以监测治疗期间的药物不良反应。出院后，患者被转诊接受标准抗结核治疗，并在完成疗程出院后随访5周进行临床评估，包括心电图检查和临床生化指标检测。

影响EBA结果的因素

患者肺部病变

EBA研究具有可重复性，但在使用相同治疗方案的不同研究之间，以及同一研究中的同一治疗组内，也经常存在变异。患者肺部病变情况是影响EBA结果的主要来源。如果患者肺部病变严重，病变部位空洞相互连接程度高，患者更易产生大量的痰液；如果肺部空洞周围形成纤维化，空洞间不易相互连接，则患者较难产生大量的痰液，使痰液的代表性降低，从而使收集的痰液之间的差异程度增大。因此，来自肺部病变不同患者的痰液之间的差异程度是EBA研究结果中重要的变异来源。另外，有研究根据患者受累肺野面积按轻、中、重度分级，并同时统计空洞存在与否及空洞大小，发现每毫升痰液CFU计数与肺脏受累肺野面积的分级程度(P<0.001)和空洞大小(P=0.001)相关。

痰液量

参与EBA研究的患者应该能够在下午18点至第2天早上8点产生至少10 ml的痰。在研究开始时只产生5 ml痰液的患者在研究的后期通常无法产生足够的痰液。较高的痰液量可增加CFU测量的精度。在较短时间内采集的样本(体积较小)中的CFU计数具有明显较大的差异。当冷冻保存时，小体积痰液中的MTB特别容易丧失生存能力。因此，需要招募痰液菌载量高的患者，以提高检测到治疗组间差异的几率。

基线痰液菌载量

基线痰液菌载量越高，治疗第0~2天的杀菌活性越大。基线痰液CFU计数每增加10倍，EBA就会上升0.094。由于在治疗的前2 d药物较高的杀菌活性似乎与预防入组患者发生治疗方案中伴随药物耐药的能力有关，如果EBA研究第0~2天的效果受到影响，这一重要能力可能会因招募基线痰液中MTB的CFU计数较低的患者所掩盖，也不能准确反映药物的剂量-效应关系。

痰液处理方法

比较NALC/NaOH方法净化痰标本和0.5% NALC或6.5 mmol二硫苏糖醇在磷酸盐缓冲液中处理痰标本的CFU计数时，发现琼脂法比NALC/NaOH法灵敏0.5~1 log10CFU/ml。因此，NALC/NaOH方法净化的痰液样本仅用于TTP检测，但不用于CFU计数。

五、痰液保存时间

Kolwijck等研究了延迟处理痰标本时间是否影响痰分枝杆菌的定量培养，发现在冷藏条件下储存1~3 d时，CFU计数不受痰量和储存时间的影响；TTP值在不同储存天数的痰标本之间的差异没有统计学意义；但随着时间的推移，它们往往会缓慢增加，当痰液体积小于5 ml时，TTP会显著延长。储存1~3 d时污染率很低，并且污染率不会随着储存时间延长而增加。延迟处理痰液可能会导致细菌代谢的轻微下降。这对储存时间较长的样本或在治疗期间收集的样本影响可能更大，因为抗结核药物的暴露会改变痰液中细菌亚群的相对比例。

六、培养污染

用于CFU计数的固体培养基平板被细菌和真菌污染是反复出现的问题。在EBA研究以及2个月治疗强化期中的菌落计数研究中，污染率从2.4%到27%不等，导致大量数据的丢失。虽然可用NALC/NaOH方法处理痰来解决，但是已证实会减少活菌CFU计数。去污净化处理另外的局限性在于可能会掩盖具有更高杀菌活性的药物(如异烟肼)的效果，从而掩盖了这些药物保护伴随药物出现耐药的可能性。与CFU计数相比，TTP检测也存在污染的问题，但其污染率较低(2%~4.7%)。

七、其他实验室因素

与可能影响EBA结果的实验室相关的因素包括痰液的不充分均质化、去污净化过程、计数MTB单个菌落的能力。真菌或其他微生物对平板的污染也可能对计数程序的准确性产生不利影响。

总 结

EBA研究患者数量相对较少，便于快速验证且相对具有较高的成本效益，但由于样本量有限，结核病患者群体和入组患者间EBA之间的比较仍然困难。为期14 d的EBA研究对于预测药物治疗方案防止肺结核复发能力的价值也是不确定的。另外，EBA研究不能评估药物的灭菌潜力，如灭菌药物利福平和吡嗪酰胺(弱EBA或无EBA)和杀菌药物环丙沙星(强EBA但不杀菌)的不同结果所示。不具有EBA的新药并不能排除该药具有灭菌活性，该活性可能在更长时间或与其他药物联合给药较长时间的研究中显现出来。

总之，EBA是新型抗结核药物首次在结核病患者中应用时进行的临床研究，也是单个抗结核药物和新的联合方案临床评价的关键。EBA研究有助于减少开发新的抗结核药物方案所需的时间，本共识的制定，将有助于规范开展及更好地推进我国抗结核新药的研发进程。

执笔者 陆宇、陈曦

专家组成员(排名不分先后) 陆宇、初乃惠、黄海荣、聂文娟、王隽、陈曦(首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所)；蔡青山(杭州市红十字会医院)；曹文利(北京老年医院)；陈晓红(福建省福州肺科医院)；陈裕(河南省传染病医院)；邓爱花(江西省胸科医院)；邓国防(深圳市第三人民医院)；杜鹃、刘冠、周铭(武汉市肺科医院)；王黎霞、李敬文、范永德(《中国防痨杂志》期刊社)；顾瑾(同济大学附属上海市肺科医院)；韩文革(山东省潍坊市第二人民医院)；金龙(黑龙江省传染病防治院)；李志惠(河北省胸科医院)；吴雪琼、梁建琴(中国人民解放军总医院第八医学中心)；梁瑞霞(河南省胸科医院)；刘爱梅(广西壮族自治区龙潭医院)；刘玉峰(青岛市胸科医院)；潘洪秋(江苏省镇江市第三人民医院)；孙鹏(吉林省结核病医院)；杨坤云、易恒仲(湖南省胸科医院/湖南省结核病防治所)；张侠(南京市第二医院)；党丽云(西安市胸科医院)；石莲(沈阳市胸科医院)