单克隆抗体生产技术于1975年由Köhler和Milstein发明。作为功能分子的单克隆抗体不仅可用于基础科学，还可用于药物、测试药物、生物传感器等领域。近年来，以单抗为主的药物在中小药品销售中占主导地位，预计到2023年底，市场收入将达到2189.7亿美元左右。

单克隆抗体有两种类型：一种是识别初级蛋白结构的线性表位的抗体，另一种是识别二级、三级和更高结构的抗体。在生命科学研究中，使用识别线性表位的抗体包括ELISA和Western blot方法。然而，使用这类抗体的应用有限，而结构识别抗体有广泛的应用，如免疫沉淀，免疫染色等。

实验流程简图

单克隆抗体是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。

^{一、免疫鼠的制备✦}

可溶性抗原的免疫原性较弱，一般需要通过添加佐剂来提高免疫效果。佐剂可以先于抗原或与抗原混合后注入动物机体内来增强抗原免疫原性，同时可以延缓抗原在体内的降解以及增强免疫应答。

常用的佐剂有弗氏佐剂、铝佐剂、水溶性佐剂等。一般情况下，免疫效果会因为小鼠个体差异和实验人员的操作而存在偏差，所以一般选择同时免疫多只小鼠进行实验。

备注：

本文将主要阐述弗氏佐剂和水溶性佐剂的两种免疫方法。

1.1 实验用材料

1.1.1 实验动物

免疫鼠制备时通常选用6-8周龄的Balb/c雌鼠。所有实验动物均需皮毛光亮，精神状态良好；维持21～27℃的恒温饲养且每日提供光照/黑暗环境12/12h循环。

1.1.2 主要试剂

1、弗氏佐剂

2、QuickAntibody-Mouse 5W 水溶性佐剂

1.2 方法

1.2.1 免疫鼠的制备

1.2.1.1 方法一：传统免疫法

弗氏不完全佐剂由矿物油（石蜡油）、乳化剂（羊毛脂）组成；弗氏完全佐剂额外添加了卡介苗或杀死的分枝杆菌。免疫时将弗氏佐剂与抗原按体积比 1：1混合，完全乳化形成油包水结构后即可用于免疫注射。

备注：

注意低温操作，以防摩擦产生的热量导致部分抗原失活。

1.2.1.2 方法二：水溶性佐剂免疫

用生理盐水将抗原稀释到 2 倍最终浓度，无菌条件下将水溶性佐剂QuickAntibody-Mouse 5W与抗原按体积比 1：1 迅速上下颠倒混匀，两条后小腿肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠注射 100μl体积。

备注：

使用前应充分混匀佐剂，与抗原混合后产生沉淀属正常现象，抽入针管后应尽快注射，建议整体实验流程控制在10min之内。

1.2.2 尾尖血测效价

1、最后一次免疫小鼠间隔2周后，取各免疫鼠尾尖血100～200μl，12000rpm，4℃，离心15min取上层血清，梯度稀释后用间接ELISA法检测血清内的抗体效价；

2、根据ELISA结果选择血清抗体效价较高的1~2只小鼠于融合实验前3天进行冲击免疫，采取腹腔注射抗原溶液。

备注：

1、若免疫效果不理想可以再通过腹腔注射（传统免疫法）或后小腿肌肉注射（水溶性佐剂法）再次免疫，间隔2~3周后重复检测血清抗体效价；

2、冲击免疫可能会造成小鼠死亡，因此建议选择~2只小鼠同时进行冲击免疫。

^{二、杂交瘤细胞融合✦}

正常小鼠通过免疫抗原的长期刺激，脾脏内的B淋巴细胞（浆细胞）可以产生针对于抗原的特异性抗体，但B细胞不具备在体外长期存活的能力。为了获取在体外可以长期生存，并且具有产生抗体能力的细胞，早期人们通过实验发现将免疫鼠的脾细胞与可无限培养的小鼠骨髓瘤细胞进行融合后可以获得既可以分泌特异性抗体，又具有无限增殖能力的杂交瘤细胞。

2.1 实验用材料

2.1.1 实验动物及细胞

用于细胞融合实验的是与免疫动物属于同一品系的SP2/0骨髓瘤细胞，这样细胞融合效率较高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生富含大量单克隆抗体的腹水。

2.1.2 主要试剂

1、50%PEG1450即用型溶液

2、HAT选择性培养基 50X

3、HT选择性培养基 50X

4、胎牛血清

5、Hybridoma Feeder添加因子

2.2 方法

2.2.1 骨髓瘤细胞SP2/0的准备

骨髓瘤细胞SP2/0细胞应大小均一透亮，形态浑圆，聚集呈葡串状。用含10%胎牛血清的1640培养基培养至对数生长期时才可以用于细胞融合。

细胞融合前1～2天，根据细胞生长状况和密度进行扩大培养（一般融合一只免疫鼠的脾脏细胞需要3～4个10mm培养皿的SP2/0细胞，细胞密度~80%）。

备注：

1、SP2/0细胞为悬浮细胞，生长速度较快，应及时换液和传代；

2、SP2/0状态的好坏将直接影响后续细胞融合实验的结果，所以调整好细胞状态是极其关键的一步。

2.2.2 融合准备

在一些细胞培养实验中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞的生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。此外，也可以选择添加特殊的细胞培养因子试剂完全代替饲养层细胞的使用，实现标准化实验操作。

在单抗制备实验中，融合时会选择小鼠腹腔巨噬细胞做饲养层，克隆化时则选择脾脏细胞做饲养细胞。

备注：

1、饲养细胞的量为一般为2×10^4或10^5 cell/well；

2、本文将阐述制备饲养层细胞和添加细胞培养因子试剂两种实验方法。

2.2.2.1 方法一：融合用饲养层细胞制备

腹腔巨噬细胞来源方便并且制备简单，最重要的是其中的巨噬细胞具有清除死亡细胞和吞噬细胞碎片的能力，因此一般融合时会选择腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞。腹腔巨噬细胞于融合前1天进行准备。一只鼠的腹腔巨噬细胞可以制备2块96孔的饲养层细胞板，一只免疫鼠的脾脏可用于融合4块96孔板。

1、取7～8周龄Balb/c雌鼠脱颈椎处死，于75%酒精浸泡消毒5min；

2、超净工作台内用无菌手术剪将小鼠腹部剪开一个小口，镊子剥离周围皮肤以便露出腹腔；

3、手术剪将腹腔剪开一个小口，用一次性无菌胶头滴管将预冷的不完全培养基注入腹腔内，沿着腹腔壁多次吹洗，将腹腔内的细胞充分悬起后转移至新的50ml离心管，重复3~4次；

4、1000~1200rpm，~5min离心，弃上清，加入适量预冷的不完全培养基重悬细胞，1000~1200rpm，~5min离心，洗涤细胞2~3次；

5、弃上清，加入1ml完全1640培养基重悬细胞，然后稀释至所需用量体积，100μl/well加入96孔板；

6、37℃，5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养，备用。

2.2.2.2 方法二：添加细胞培养因子

1、融合和亚克隆阶段：10%（v/v）Hybridoma Feeder添加因子加入到完全培养基中；

2、细胞扩大培养和复苏阶段：2.5%-5%（v/v）Hybridoma Feeder添加因子加入到完全培养基中

备注：

添加因子只作为细胞培养添加剂使用，不可代替血清。

2.2.3 免疫鼠脾细胞的准备

细胞融合当天取三天前冲击免疫过的小鼠作为免疫脾细胞的来源，一般情况下免疫小鼠的脾脏体积大小是正常小鼠的两倍。

1、免疫小鼠脱颈椎处死，于75%酒精浸泡消毒5min；

2、在超净工作台内用高压灭菌好的手术剪将小鼠胸腔左下侧开一个小口；

3、用镊子摘取脾脏后放于含3~5ml不完全培养基的皿中，剔除周围结缔组织；

4、将脾脏转移至润湿的0.4目筛网中用研磨棒轻柔研磨，加入适量预冷的不完全培养基制成细胞悬液，1000~1200rpm，~5min离心；

5、弃上清，适量不完全培养基重悬细胞，1000~1200rpm，~5min离心，洗涤细胞2~3次；

6、适量不完全培养基重悬细胞，计数后备用。

备注：

研磨脾脏时需要保证筛网湿润且研磨力度不能过大，全程注意无菌操作。

2.2.4 融合

准备~25ml不完全培养基作为融合终止液与配置好的PEG溶液提前放于37℃细胞培养箱进行预热。融合前用枪将SP2/0细胞从培养皿底吹下悬起，收集于50ml离心管内，1000~1200rpm，~5min离心，洗涤细胞2~3次，再加入10ml不完全培养基重悬细胞，计数后备用。

1、分别将1×10^8小鼠脾细胞和2×10^7骨髓瘤细胞重悬于25ml无血清培养基中（用50mL一次性离心管）；

备注：

融合时将骨髓瘤细胞SP2/0和免疫鼠脾细胞比例调至1:5~1:10的融合效果最好

2、200~400g，离心5~10 min，弃去上清；

备注：

尽量去除干净，避免稀释PEG影响融合效果

3、轻拍管底，充分打散沉淀，将1ml经过37℃预热的50% PEG 1450匀速加入离心管中（用1ml的移液器，1 min内加完），期间用移液器枪头轻柔搅拌；

4、持续缓慢的用枪头搅拌1~2分钟；

5、匀速加入1ml经过37℃预热的不完全培养基（1 min内加完），期间用移液器枪头轻柔搅拌；

6、再匀速加入3ml经过37℃预热的培养基（3 min内加完），期间用移液器枪头轻柔搅拌；

7、再加入10ml经过37℃预热的培养基。37℃孵育5 min，200~400g离心~5分钟取细胞；

8、弃上清，加入10ml完全培养基轻轻悬起融合的细胞后再稀释至所需用量（融合4块96孔板，需加至42ml）；

9、将融合好的细胞加入到完全培养基中种入昨日提前准备好的96孔细胞板中，100μl/well，37℃，5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养；

10、融合后24小时内补加含HAT的选择性补液培养基，50μl/well；

11、补液两天后进行第一次半换液，每孔吸出50～80μl的培养基，第一次半换液培养基内HAT含量减半，50μl/well；

12、再过两天后进行第二次半换液，每孔吸出50～80μl培养基，换成含HT的培养基，50μl/well。

备注：

左图为融合后图片，大而圆形透亮的细胞为融合成功细胞；右图为筛选培养后的图片，圆形透亮的为筛选培养成功的杂交瘤细胞。

^{三、杂交瘤细胞克隆化✦}

杂交瘤细胞的克隆化一般是指针对于抗体阳性孔的克隆化。在实际实验操作中，会有数个或者更多的克隆，其中可能包括所需的抗体分泌细胞，抗体非分泌细胞，及其他无关抗体的分泌细胞。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化。因为非抗体分泌细胞的生长速度比抗体分泌细胞的生长速度快，抗体分泌细胞的生长就会被抑制，最终二者的竞争结果会造成抗体分泌细胞的丢失。

一般通过使用有限梯度稀释法对杂交瘤细胞进行多次克隆化筛选，在细胞群体中选育出遗传稳定的同源细胞系。该细胞系是可以稳定分泌单一抗体的杂交瘤细胞。

3.1 实验用材料

主要试剂：

1、胎牛血清

2、HT选择性培养基 50X

3.2 方法

有限稀释法克隆化

第一次克隆化时，融合后的杂交瘤细胞状态还很脆弱，所以我们使用含HT和20%胎牛血清的完全1640完全培养基进行克隆化。后续可以使用正常的含10~20%血清的完全培养基进行克隆化。克隆化时选择脾脏细胞做饲养细胞，具体实验操作步骤如上。

1、把挑选出来的阳性孔内的细胞完全吹悬后镜下细胞计数，在5ml青霉素小瓶或离心管内用完全1640培养基进行梯度稀释；

2、每一浓度梯度的细胞悬液加入96孔脾细胞饲养层板中，100μl/well，同一浓度梯度种2～3列细胞孔，一般一个阳性孔我们会选择有限梯度稀释后克隆化半块或者一块96孔板，相应的稀释3～4个浓度梯度；

3、37℃，5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养，第5～6天后镜下观察细胞生长状态，适当补加培养基，同时可用记号笔在板底圈出单/少个杂交瘤细胞团生长的细胞孔，方便后续检测使用；

4、当标记孔内的杂交瘤细胞布满1/10底面积时，可用间接ELISA法检测细胞上清中的抗体含量。

备注：

1、图为单个杂交瘤细胞团；

2、每次克隆化检测后，优先挑选细胞上清中抗体效价高，孔内单/少个克隆细胞生长，形态良好的细胞孔以进行下一次的克隆化。并根据细胞生长状况尽快进行下一次克隆化；

3、第一次克隆化时为了确保杂交瘤细胞能够稳定生长，可在克隆化时将每孔内的细胞密度稀释至5、2、1个细胞。后续克隆化时为了保证可以逐渐形成单克隆细胞株，可将每孔内的细胞密度调至2、1、0.5个细胞。

^{四、抗体亚型鉴定及腹水制备✦}

不同亚型的抗体在结构上有所区别，其免疫源性与在体内发挥的作用存在差异，在生物体内具有不同的功能效应，因此在筛选杂交瘤时需要确定高表达量的阳性克隆是否是所需要的亚型分子；而且，明确抗体的亚型有助于选择更加适合的抗体纯化方法，从而获得更高的抗体获得率；对抗体进行进一步的细分，并进行抗体亚型鉴定，对于疾病作用机理的研究和抗体药物的开发，均有重要意义。

大量生产单克隆抗体的方法主要有三种：（1） 大量培养杂交瘤细胞，从细胞培养上清液中获取的抗体含量为10～60μg/ml；（2） 将对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×10^7/ml接种于小鼠皮下，每处注射0.2ml，每只注射2～4个点，待10～20天左右即可进行采血，抗体的含量可达1～10mg/ml；（3）小鼠腹腔注射适量佐剂后，将杂交瘤细胞按照1～2×10^6cell/只的量打进腹腔。在小鼠濒死时收集腹水，一般一只小鼠可获得5～10ml腹水，抗体含量可达5～10mg/ml。

4.1 实验用材料

4.1.1 实验动物

腹水制备时通常选用10~11周龄的Balb/c雌鼠，所有实验动物均皮毛光亮，精神状态良好。维持21～27℃的饲养温度且每日提供光照/黑暗环境12/12h循环。

4.1.2 主要试剂

1、小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用ELISA试剂盒(IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\ IgM\IgA\Kappa\Lambda)

2、腹水专用佐剂

4.2 方法

4.2.1 抗体亚型鉴定

抗体是在机体内产生的“Y”构型的免疫球蛋白，基于小分子多肽结构上的差异，可细分为重链和轻链。重链可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE5类，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。不同类的Ig具有不同的特征，即使是同一类的Ig，因其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数量、位置不同，又可将同类Ig分为不同的亚类。轻链可分为κ链和λ链两类，根据λ链恒定区个别氨基酸的差异，又可将λ链分为λl、λ2、λ3和λ4四个亚型。

常规小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用ELISA试剂盒利用双抗体夹心法鉴定小鼠淋巴细胞杂交瘤培养上清中单克隆抗体或特异亲和纯化的单克隆抗体的类和亚类。

4.2.2 腹水制备

1、将佐剂注射Balb/c小鼠腹腔，每只0.3~0.5ml处理腹腔7~15天左右，将筛选出来的杂交瘤细胞株扩大培养后接种到Balb/c小鼠腹腔内；

2、注射杂交瘤细胞7天左右小鼠腹部会开始肿胀，此时每日都应进行观察，以防小鼠突然死亡，当小鼠出现进食困难，行走不便，毛色暗沉时将小鼠处死，进行一次性腹水的提取；

3、小鼠脱颈椎处死，于75%酒精浸泡消毒5min；

4、用手术剪将小鼠腹部剪开一个小口，剥离周围皮肤露出腹腔，随后将腹腔剪开一个小口，将胶头滴管伸入腹腔内将积液吸取至干净的15ml离心管内；

5、3000rpm，10min离心，无色透明的中间层即为腹水。

备注：

离心后可以将腹水转移至新的离心管内-20℃冻存（上层为矿物油层，下层为细胞层），也可与灭菌甘油等比混匀后放于-20℃冰箱长期保存。

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